《CHD1L在食管鳞癌中的表达及临床意义和CHD1L在食管癌细胞系中的表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CHD1L在食管鳞癌中的表达及临床意义和CHD1L在食管癌细胞系中的表达（70页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、B yL iF a n g f a n gS u p e r v i s o r ：P r o f Y a n mq i nD e p a r t m e n to fO n c o l o g yM e d i c a lS c h o o lA p r i l ，2 0 1 2s q u a m o u sh a g e a l原创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。文中除已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担
2、。r学位论文作嘞日期，p 年f 月如日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作嗡考嗍蚴年f 月弓。日导师秦艳茹教授郑州大学第一附属医院肿瘤科河南郑州4 5 0 0
3、5 2摘要背景与目的食管癌是人类最常见的六大恶性肿瘤之一，是中国恶性肿瘤致死率排名第四，世界恶性肿瘤死亡率第四的肿瘤。它的分布表现为明显的区域性特征，在我国主要集中在太行山区一带，发病率由高到低呈同心圆向外分布。其中，河南安阳林州市和其毗邻的辉县是我国乃至是世界上发病率最高的两个地区，且以食管鳞状细胞癌为主。由于食管癌的发病率高，预后极差，其病因学研究引起了世界尤其是中国学者的广泛关注。食管癌的发生与其他肿瘤一样，也是一个多基因多步骤的过程。在细胞发生癌变的过程中，细胞周期中的多种调节因子对细胞的癌变具有作用。其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是细胞癌变的分子基础。正常情况下，细胞原癌基因在维持
4、细胞信号转导和增殖过程中起着重要作用。当原癌基因被激活转变为癌基因时，通过高表达或表达功能异常的蛋白产物致癌。目前发现与食管癌相关的癌基因主要有：R a s ，C - m y e ，E G F R ，e - J u n ，M D M 2 ，M T A1 ，h F R I ，c - f o s ，C y c l i n D ，C e r b B 2 ，i n t - 2 等。C H D1L ( C h r o m o d o m a i nh e l i c a s e A T P a s eD N Ab i n d i n gp r o t e i nl - l i k eg e n e )
5、是香港大学关新元教授用染色体显微切割技术结合比较基因组杂交技术，首次从人体肝癌细胞的染色体l q 2 1 区分离并克隆的一个新基因。该基因又被称为A L C l ( A m p l i f i e di nl i v e rc a n c e r1 ，基因库登记号A F 5 3 7 2 1 3 ) ，基因全长2 9 8 0 b p ，编码8 9 k D a 分子蛋白。研究发现C H D l L 在肝癌常常呈现高表达，且通过对转染了该基摘要因的细胞相关功能实验及其分子机制的研究，进一步证实了C H D l L 可能作为一个新的肝癌候选基因出现。但是，C H D l L 基因与食管癌的发生发展关系
6、的相关报道尚未发现。关于C H D l L 毛E 肝癌方面的研究表B 韭J C H D l L 主要通过下调p 5 3 及其下游效应基l 园p 2 1 、上调C d k 2 以及C v c l i n E 等基因表达，促进D N A 合成及G 1 S 周期转换，从而调控细胞的增殖和凋亡过程，导致肿瘤的发生。本实验研究采用半定量P C R ( R T - P C R ) 和荧光实时定量P C R ( q P C R ) 在m R N A 水平检澳J J C H D l L 在食管鳞状细胞癌的表达情况；采用免疫组化的方法检测c H D l L 在食管鳞癌中蛋白水平的表达情况，从而进一步深刻探讨该基
7、因的临床意义。并且通过半定量P C R 和荧光实时定量P C R 检测该基因在食管癌细胞系中的表达，筛选出表达较低的食管癌细胞系K Y S E 3 0 和K Y S E 5 1 0 ，以及显著高表达的食管癌细胞系K Y S E l 8 0和H K E S C l ，G 4 1 8 和p u r o m y c i n 分别筛选以上细胞株的最佳药物浓度，为下一步筛选稳定克隆和功能和分子机制研究奠定基础。材料与方法1 选取河南省林州市人民医院2 0 1 0 年7 月至2 0 1 0 年l O 月期间5 0 例食管癌手术标本及其相应的癌旁食管正常粘膜组织( 食管正常粘膜组织距离病灶 5 e r a
8、) ，以及来源于该院2 0 0 2 年2 月至2 0 0 8 年1 2 月期间的2 8 9 例食管癌石蜡包埋标本。所有手术标本H E 切片病理学检测均证实为食管鳞癌。以上所有病例手术前均未经过放疗、化疗和免疫治疗。2 采用半定量P C R 及荧光实时定量P C R 方法检测5 0 例食管鳞癌组织及其相应的癌旁食管正常粘膜组织中C H D l L m R N A 的表达情况。3 采用免疫组织化学法检测2 8 9 例食管鳞癌组织及其相应的癌旁食管正常粘膜组织中C H D l L 蛋白的表达情况。4 采用S P S S16 0 统计软件包，统计方法采用独立S t u d e n t s 检验、C h
9、 i - s q u a r e检验，检验水准为a = O 0 5 。K a p l a n M e i e r 分析C H D l L 表达与食管癌患者的生存关系。5 采用半定量P C R 及荧光实时定量P C R 方法检测7 株食管癌细胞系中C H D l L 的表达，筛选出表达最高的两株细胞株及表达最低的两株细胞株。6 G 4 1 8 筛选表达低的K Y S E 3 0 及K Y S E 5 1 0 两株食管癌细胞系的最佳药物浓度；p u r o m y c i n 筛选表达高的食管癌细胞系K Y S E l 8 0 和H K E S C l 的最佳药物I I摘要浓度。复士甲0 口刁1
10、5 0 例食管鳞状细胞癌组织及其相应的癌旁食管正常粘膜组织中，3 1 例食管鳞癌组织C H D l L 的表达高于相应的癌旁正常组织6 2 0 ( 3 1 5 0 ) ：5 例食管鳞癌组织C H D l L 的表达低于相应的癌旁正常组织1 0 ( 5 5 0 ) 。P C R 结果显示：C H D l L 在m R N A 水平的表达在食管鳞癌组织及其相应的癌旁食管正常粘膜组织间的差异具有统计学意义( p 0 0 5 ) 。5 C H D l L 蛋白高表达的食管鳞癌患者的5 年生存率( 2 8 8 ) 明显低于C H D I L 蛋白正常表达的食管鳞癌患者( 3 6 7 ，p O 0 5 )
11、 5 1 1 1 e5 - y e a ro v e r a l ls u r v i v a lo fC H D1Lo v e r - e x p r e s s i o ni nE S C CC a s e s( 2 8 8 ) w a ss i g n i f i c a n t l yl O W e rt h a nt h a ti nE S C Cc a s e sw i t hn o r m a lC H D l Le x p r e s s i o n ( 3 6 7 p 6 0 岁的1 8 例， = - 3 9 岁， 5 c m ) 。以上所有食管癌组织及其相应癌旁正常组织样本
12、多聚甲醛常规固定，石蜡包埋，切片、H E 染色。所有手术标本H E 切片病理均证实为食管鳞状细胞癌。将以上2 8 9 例食管鳞癌组织及其相应癌旁正常组织样本构建食管癌组织芯片。经免疫组织染色后有4 4 例食管癌组织标本缺失，剩余2 4 5 例中：男性1 0 9名，女性1 3 6 名；年龄 - - - - 4 0 岁 = - l m l7 5 乙醇洗涤沉淀；用手振荡混匀；2 8 条件下， = 1分钟；( 3 ) 瞬间离心后在管中加入以下试剂：5x F i r s t - s t r a n dB u f f e r4 u l0 1 MD “ I Tl u lS u p e r s c r i p
13、 tI Hl u lR n a s eI n h i b i t o rl u l( 4 ) 移液枪轻柔吸打混匀，瞬间离心管壁液体至管底；( 5 ) 5 0 孵育1 小时；( 6 ) 7 0 “ C 孵育1 5 分钟灭活酶活性，8 0 。C 冰箱保存产物。2 1 3 食管癌组织及其癌旁正常组织的R T - P C R根据G e n e b a n k 公布的人C H D l L e D N A ( N M0 0 4 2 8 4 3 ) 序列，采用引物设计软件P r i m e rP r e m i e r 5 0 设计C H D l L 引物如下：C H DlL R T - FI ：g g t
14、 g g a g t t g g c a t g a a c t tC H D1L R r - R 1 ：c a c t e a a c t g g a g g t c a g c aR T - P C R2 5 u l 体系成份：G o T a q12 5 u lP r i m e rF 1l u lP r i m e rR 1l u ld d H 2 09 5 u lT e m p l a t ee D N Alu lP C R 条件：9 4 “ C 预变性5 m i n ；9 5 3 0 s- q6 0 3 0 s卜3 0C y c l e s7 2 I m i n7 2 “ C 延伸5
15、 m i n ；8材料和方法4 保存P C R 产物。以G A P D H 做内参，引物如下：G A P D H I U - F1 ：C G G G A A G C T r G T C A T C A A T G GG A P D H R T - R 1 ：G G C A G T G A T G G C A T G G A C T G I m P C R2 5 u l 体系成份：G o T a q1 2 5 u lP r i m e rF 1l u lP r i m e rR ll u ld d H 2 09 5 u lT e m p l a t ec D N Alu lP C R 条件：2
16、1 4 食管癌组织及其癌旁正常组织荧光实时定量P C R ( q P C R )用以上逆转录的c D N A 为模板，应用P o w e rS Y B RG r e e nP C RM a s t e rM i xK i t进行荧光实时定量P C R 。扩增反应条件：9 5 “ 1 21 5 秒，6 0 6 0 秒，共4 0 个循环反应。应用A B IP R I S M7 9 0 0S e q u e n c eD e t e c t o r 序列检测系统对反应产物进行定量测定和融解曲线分析，进行三次平行实验。以t h r e s h o l dc y c l e ( C D 法分析食管癌中C H D l L 含量相对于癌旁相对正常食管粘膜组织和内参G A P D H 的变化，对应的表达水平以相应的倍数变化体现，用以下公式计算：R Q 值= 2 - A A C T ( A A C T= A C T T u m o r A C T N o n
