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1、【摘要】 目的:探讨创伤弧菌（Vibrio vulnificus，VV）脓毒症大鼠肺组织脂多糖受体 CD14 mRNA、核因子-B（NF-B）基因的表达及其动态变化。方法:SD 雄性大鼠 60 只， 随机分为 6 组，每组 10 只。第 1 组：正常对照组（NC 组） ；第 26 组为 VV 组: 予大鼠 下肢皮下注射 VV，造成 VV 脓毒症模型，以注射 VV 后 2、6、9、12、16 h 各时间点分别 为 26 组。取各组大鼠部分肺组织，用 RT-PCR 法测定大鼠肺组织不同时间点 CD14 mRNA、NF-B mRNA 的表达。结果: NC 组大鼠肺组织有少量 CD14、NF-B mR
2、NA 表 达，分别为 0.3920.056 和 0.3660.179。感染 VV 后大鼠肺组织 CD14 mRNA 表达增加， 2、6、9、12、16 h 的表达量分别为0.9760.180，1.1480.218，1.0260.033，0.9880.129，0.9700.125。大鼠肺组织 NF- B mRNA 表达量也明显增加，2、6、9、12、16 h 的表达量分别为 0.7630.215，1.1000.101，1.0680.174，1.0570.076 和 0.8000.205。与 NC 组相比， 二者均明显升高（P0.05） 。结论:VV 脓毒症大鼠肺组织 CD14、NF-B 的基因表
3、达水平 在脓毒症中明显升高，其与脓毒症的发生、发展密切相关，动态监测其改变对 VV 脓毒症 发病过程具有一定的预警意义。 【关键词】 创伤弧菌；脓毒症；脂多糖受体 CD14；核因子-B；基因Gene expression and the dynamic change of pulmonary lipopolysaccharide receptor CD14 and NF-B in rats with Vibrio vulnificus sepsis ZHENG A-mai*，CHEN Yu-xi，LI Meng- fang，LIANG Huan，LU Zhong-qiu. *Departmen
4、t of Emergercy Medical，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou，325000Abstract: Objective: To detect the Gene expression and the dynamic change of pulmonary lipopolysaccharide receptor CD14 and NF-B in rats with Vibrio vulnificus (VV) sepsis. Methods: Sixty male Sprague-Dawl
5、ey (SD) rats were equally divided into six groups randomly. The first group was named control group. VV groups include the second to sixth group which were injected VV to make VV sepsis model. Samples were taken from control group and the second group to the sixth group at the timepoint of 2，6，9，12，
6、16 h after injection respectively，the genes of pulmonary lipopolysaccharide receptor CD14 and NF-B in ratslung were measured in the different time by the method of RT-PCR. Results: The Gene expression of pulmonary lipopolysaccharide receptor CD14 and NF-B in the control group was a low level（0.3920.
7、056，0.3660.179） ，but they increased significantly at 2 h（0.9760.180，0.7630.215） ，6 h（1.1480.218，1.1000.101） ，9 h（1.0260.033，1.0680.174） ，12 h（0.9880.129，1.0570.076） ，16 h（0.9700.125，0.8000.205）after VV being injected（P 0.05）. Conclusion: Our data suggest that the Gene expression of pulmonary lipopol
8、ysaccharide receptor CD14 and NF-B elevation are associated with the development of VV sepsis. Monitoring the change of the Gene expression of pulmonary lipopolysaccharide receptor CD14 and NF-B in the lung have the benefit of mastering the VV sepsis progress.Key words: Vibrio vulnificus；sepsis；CD14
9、；NF-B；gene创伤弧菌（Vibrio vulnificus，VV）是一种高致死性嗜盐性 G-弧菌，可引起严重的伤 口感染、脓毒症等1。CD14 作为脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的重要受体，与脂多糖结合蛋白（Lipopolysaccharide-Binding Protein，LBP）共同作用可明显提高各种细胞对内 毒素的敏感性，在炎症反应、脓毒症等病理反应中起重要作用，其在脓毒症中的地位日益 受到重视2。核转录因子-B (NF -B) 是细胞内普遍存在的重要转录因子，对许多细胞 因子和炎性递质的基因都有调控作用3。我们通过制作大鼠 VV 脓毒症模型，测定肺组织
10、CD14、NF-B 的基因的表达及其动态变化，并探讨 VV 脓毒症时肺组织 CD14、NF-B 的基因的表达动态变化和规律，为进一步研究创伤弧菌脓毒症发病机制提供资料。1 材料和方法1.1 实验动物 清洁级 Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠 60 只，体重为 270300 g， 由温州医学院动物实验中心提供（许可证为 SCXK(沪) 2003- 0003） 。1.2 细菌来源 从 VV 感染患者下肢血疱中抽取疱液，接种在血平板上，37 、24 h 培养分离纯化，细菌鉴定为 VV，菌株编号为 812013，按常规方法制作成创伤弧菌悬液， 浓度为 9108 cfu/ml 备用。1.3
11、实验材料 Trizol 试剂，逆转录试剂盒均由 Invitrogen 公司提供。PCR 试剂盒由 Fermentas 公司提供。Rat CD14 引物（引物序列：Forward 5- GTGCTCCTGCCCAGTGAAAGAT-3，Reverse5-GATCTGTCTGACAACCCTGAGT- 3，PCR 产物长度: 268 bp） ，Rat NF-B（引物序列：Forward 5- CCAGATCAATGGCTACACGG-3，Reverse 5-CGCATTCAAGTCATAGTCCC-3，PCR 产 物长度: 286 bp） ，Rat -actin 引物（引物序列：Forward 5
12、- TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3，Reverse 5-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3，PCR 产物长度: 315 bp）由上海生物工程公司合成。酶标仪由 BioRAD 公司提供。梯度 PCR 仪 由 Eppendof 公司提供。水平电泳仪由北京六一电泳厂提供。凝胶成像分析系统由 Pharmacia 公司提供。1.4 实验方法1.4.1 建立大鼠 VV 脓毒症模型。SD 雄性大鼠 60 只，购来后饲养 1 周以上，实验前 禁食 12 h，自由进水。随机分为 6 组，每组 10 只。第 1 组：正常对照组（NC 组） ，麻醉 后处死。第 26 组：VV 脓毒症组（
13、VV 组） ，予双下肢皮下注射 VV，细菌浓度为 9108 cfu/ml，剂量为 1 ml/100 g，制作 VV 脓毒症模型。大鼠脓毒症模型诊断标准参照文献4。 VV 组大鼠分别在注射创伤弧菌后 2、6、9、12、16 h 各时间点分别为 26 组，麻醉后处 死。无菌取部分肺组织，用 4 生理盐水冲洗后迅速置于液氮中保存待用。1.4.2 RT-PCR 法测定大鼠肺组织 CD14、NF-B 的 mRNA 表达。取冻存大鼠肺组 织约 50 mg，按 Trizol 说明书，提取大鼠肺组织总 RNA。用分光光度计检测总 RNA 的浓 度和纯度，要求 OD260/OD280 比值在 1.82.0 之间
14、。根据逆转录试剂盒说明书进行逆转 录反应。用 1.5%琼脂糖凝进行电泳。同时加合适的 DNA ladder。采用凝胶成像分析系统观 察电泳结果，并用 Quantity One 软件进行凝胶扫描分析。以目的基因/-actin 为该基因表 达的相对值。1.5 统计学处理方法 采用单因素方差分析，并用 LSD 法进行组间两两比较。2 结果2.1 VV 脓毒症大鼠肺组织 CD14 mRNA 的表达 NC 组大鼠肺组织有少量 CD14 mRNA 表达量为（0.3920.056） ，感染 VV 后其表达增加，VV 组染菌后 2、6、9、12、16 h 肺组织的 CD14 mRNA 表达量分别为0.9760
15、.180、1.1480.218、1.0260.033、0.9880.129、0.9700.125，与 NC 组相比， 均明显升高（F36.30，P0.05） ，其中以染菌后 6 h 的表达量最高，9 h 后其表达量较前 有所降低，但染菌 16 h 的表达量仍明显高于正常水平。2.2 VV 脓毒症大鼠肺组织 NF-B mRNA 的表达 NC 组大鼠肺组织 NF-B mRNA 表达量低（为 0.3660.179） ，感染 VV 后其表达增加，VV 组染菌后 2、6、9、12、16 h 肺组织的 NF-B mRNA 表达量分别为0.7630.215、1.1000.101、1.0680.174、1.0
16、570.076、0.8000.205，与 NC 组相比， 均明显升高（F28.58，P0.05） ，其中以染菌后 6 h 的表达量最高。3 讨论VV 是一种嗜盐性 G-弧菌，在热带、亚热带环境中，可广泛存在于海水及海产品中， 可通过生食海鲜和经过肢体破损创口感染人体，迅速发展为脓毒症，死亡率高达 70%以上， 是一种沿海地区发生的致命性疾病。脓毒症及其引发的多器官功能障碍综合征（MODS） 是 VV 脓毒症患者死亡的主要原因5。作为急性肺损伤（ALI）或急性呼吸窘迫综合征 （ARDS）最常见的致病因素，脓毒症所致的 MODS 往往最先导致 ALI，在此基础上恶化， 累及其他脏器，以致发生 MODS6。ALI 的病理基础是广泛的肺泡-毛细血管膜损伤，这 种损伤可原发于侵袭肺的理化或生物性因子的直接作用，但更
