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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ MDM2 基因的表达基因的表达作者：刘壮，谭丽珍，吴香芩，张义堂，韦红英 作者单位：广西南宁，广西医科大学第一附属医院儿科 广西柳州，柳州中医院肿瘤科【摘要】 目的 探讨 MDM2 基因 mRNA 的表达与儿童急性白血病(AL)的关系。方法 采用逆转录多聚酶链式反应技术(RT-PCR)，对 42 例初发或复发 AL 患儿和 13 例完全缓解 AL(AL-CR)患儿及 15 例非恶性疾病患儿骨髓单个核细胞进行 MDM2 mRNA 表达的检测。结果 AL 组中 MDM2 mRNA 的表达率为 57.1%，明显高于AL-CR 组和对照组;完全缓解组和对照组差
2、异无显著性。MDM2 mRNA 的表达与白细胞总数及临床危险度分型有关，与性别、年龄、免疫分型无明显相关性。MDM2 mRNA 表达者缓解率低。结论 儿童 AL 中存在 MDM2 mRNA 过表达，且可能与儿童 AL 发病有关;MDM2 mRNA 表达是 AL 的不良预后因素;AL MDM2 mRNA 表达者可以降低 AL 的化疗敏感性，MDM2 mRNA 表达对 AL 有疗效判断和预后的价值。【关键词】 急性白血病;儿童; MDM2; 逆转录多聚酶链式反应Expression of MDM2 gene in childhood acute leukemiaLIU Zhuang, TAN Li
3、-zhen, WU Xiang-qin, et al.Department of Pediatrics, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 530021,China【Abstract】 Objective To investigate the expression and significance of MDM2 gene in childhood acute leukemia (AL). Methods The mRNA expression of MDM2 ge
4、ne was examined by RT-PCR in bone marrow cells from 42 cases of incipient or relapsed childhood AL, 13 cases of complete remission AL (AL-CR) and 15 children without malignance disease as control group.Results 57.1% AL cases were positive for MDM2 mRNA, remarkably significant higher than that of con
5、trol group and AL-CR group. There was no difference of MDM2 mRNA expression between AL-CR group and control group. The expression of MDM2 mRNA was connected with initial white blood cell (WBC) count and clinical risk type of AL. There was no connection between MDM2 mRNA expression and some clinical
6、and laboratory parameters such as age, sex and immunogenic type. The remission rate in patients with high expression of MDM2 mRNA was lower. Conclusion There is over expression of MDM2 mRNA in childhood acute leukemia, which may be related to pathogenesis of AL. The expression of MDM2 may imply high
7、er risk and lower sensitivity of the leukemic cells to chemotherapy. The expression of MDM2 mRNA might be the index of treatment effect and poor prognosis.【Key words】 acute leukemia; child; MDM2; reverse transcription-polymerase chain reactionKKME-专业医学搜索引擎 http:/ double minute 2)基因是从自然转化的 Bal B/C 小鼠
8、细胞株中发现的癌基因，它编码一种 DNA 结合蛋白，该蛋白与 p53 蛋白形成复合体，致 p53 失去对肿瘤活性的抑制作用，从而导致肿瘤的发生和发展，造成肿瘤对放疗、化疗的耐受，与不良预后有关1,2 。为探讨儿童急性白血病的 MDM2 过度表达的发生率及其与疾病的发生发展的关系，笔者采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)的方法对儿童急性白血病(AL)患者骨髓单个核细胞 MDM2 mRNA 的表达进行了检测，现报告如下。1 对象与方法1.1 研究对象 病例组：初发及复发未治 AL 组 42 例，为2004 年 2 月2006 年 11 月期间在广西医科大学第一附属医院儿科住院的 AL 初发及复
9、发且未经治疗患儿，均经骨髓细胞学检查确诊。其中 ALL 32 例(其中 L1 3 例、L2 27 例、L3 2 例)，ANLL 10 例(M2a 4 例、M2b 1 例、M3a 3 例、M3b 1 例、M4b 1 例)。男 27 例，女 15 例;年龄 214 岁，中位年龄 8 岁。初发组 35 例，复发组 7 例。初发组中 ALL 26 例，其中 B-ALL 16 例，T-ALL 5 例，5 例未进行免疫分型，ANLL 9 例。初发组中高危 8 例，标危 27 例。诊断及分型依据文献3，各组性别、年龄等条件相似。缓解组(AL-CR 组)13例，为同期住院的 AL 治疗后达完全缓解(CR)患儿
10、，其中男 9 例，女 4 例;年龄 3.814 岁，中位年龄 8.6 岁。均经骨髓细胞学检查证实为 AL-CR。 对照组 15 例，为同期住院的非恶性血液病(特发性血小板减少性紫癜、缺铁性贫血等),男 9 例，女 6 例;年龄 314 岁，KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 8.9 岁。1.2 方法1.2.1 标本采集 骨髓涂片后,抽取骨髓液 12 ml，ACD 抗凝，采用 Ficoll 密度梯度离心分离出单个核细胞(MNC)，PBS 洗涤2 次，-80保存。1.2.2 总 RNA 提取 按照 Trizol 试剂盒(Gibco BRL Invitrogen，USA)说明提取总 RNA。用
11、紫外分光光度计测定 RNA 纯度(A260/A2801.8)，同时进行 RNA 定量，并经甲醛琼脂糖凝胶电泳证实 RNA 完整。-80保存备用。1.2.3 cDNA 逆转录反应 20.0l 反应体系, 总 RNA 2l(1g/l), oligo(dT)18 1.0l 引物 1.0l,去离子水 9.0l,混匀。70 5min,冰浴冷却,离心混匀,加下列反应物:5缓冲液 4.0l, dNTPs (10mmol/L)2.0l, RNasin 1.0l,混匀,37 5min,然后加入 M-MuLV 逆转录酶 (200u/l)1.0l，42 60min,70 10min,冰浴冷却终止反应。-20保存待用
12、。1.2.4 MDM2 cDNA 的 PCR 反应 引物设计参考文献4,由上海生工公司合成。MDM2 有意义链引物:5-TTATTAAAGTCTGTTGGTGCA-3,反意义链引物:5-TGAAGGTTTCTCTTCCTGAAG-3,扩增产物长度 336bp。内对照-actin 上游引物 5-AAGAGAGGCATCCTCACCCT-3,-actin下游引物 5-TACATG GCTGGGGTGTTGAA-3,扩增产物长度218bp。反应体系 40.0l,取 cDNA 产物 10.0l,加 dNTPs、缓冲液、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 与 -actin 引物、去离子水。终浓度为
13、：dNTPs 0.2mol/L,MgCl2 2.5mol/L,各引物浓度均为 25pmol/L。94预反应4min,加 Taq 酶 2.0u，进行 32 个 PCR 循环,每循环 94 45s、54 40s、74 40s,终末延伸 725min。1.2.5 PCR 产物分析 2.0%琼脂糖凝胶电泳 80min,在紫外光下观察,用 BIO RAD 公司的凝胶图像分析软件进行吸光度(A 值)分析,计算 MDM2 /-actin 值,以此得到 MDM2 基因表达水平。参照文献4的评定标准,以 MDM2 /-actin 的比值16%为 MDM2 mRNA 过表达。1.3 统计学处理 使用 SPSS10
14、.0 软件包对实验结果进行统计学处理，对数据进行卡方检验、Fisher 精确概率法。2 结果2.1 病例组和对照组 MDM2 mRNA 的表达 见表 1。42 例AL 中有 24 例 MDM2 表达，表达率为 57.1%，13 例 AL-CR 及 15例对照组中无 MDM2 mRNA 表达，MDM2 mRNA 表达率在 AL 组与对照组、AL 组与 AL-CR 组之间均差异有显著性(P=0.0002，P=0.0001);AL-CR 组和对照组比较差异无显著性(P=1.000)。表 1 MDM2 mRNA 在病例组和对照组的表达2.2 AL 初发组与复发组 MDM2 mRNA 的表达比较 35
15、例AL 初发组中 MDM2 mRNA 过度表达 19 例，表达率为 54.3%，7 例AL 复发组中 MDM2 mRNA 表达 5 例，表达率为 71.4%，两者之间差异无显著性(P=0.675)。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ MDM2 mRNA 表达与化疗反应的关系 见表 2。AL 组中有 19 例患者完成了诱导缓解化疗，其中初发 AL 13 例、复发 AL 6 例。初发 13 例中诱导化疗后达完全缓解(CR)10 例，未缓解(NR)3例，6 例复发病例中，CR 2 例，NR 4 例。CR 与 NR 病例的 MDM2 mRNA 表达水平无论是治疗前还是治疗后均差异有显著性，NR 患者表达水平显著高于 CR 患者(P 均0.05)。表 2 儿童 AL MDM2 mRNA 表达与化疗反应的关系注：采用秩和检验，NR 与 CR组比较，P0.05。CR：完全缓解;NR：未缓解2.4 AL 初发组 MDM2 mRNA 表达水平与临床特征及临床分型的关系 见表 3。WBC100109/L 患儿与 WBC100109/L患儿之间、高危型患儿与标危型患儿之间均差异有显著性。在年龄10 岁或1 岁与 110 岁患儿之间、男性与女性之间、T-ALL 和B-ALL 之间均差异无显著性。表 3 MDM2 mRNA 表达水平与儿童AL 临床特征及临床分型的关系3 讨论MDM2
