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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ NOTCH3 基因诊断基因诊断伴皮质下梗死及白质脑病常染色体显性遗传性脑动脉病的 NOTCH3基因诊断作者：唐晓梅 作者单位：100053 北京，首都医科大学宣武医院老年病研究所 【摘要】 目的 分析伴皮质下梗死及白质脑病常染色体显性遗传性脑动脉病（CADASIL）的 NOTCH3 基因突变类型。方法 对临床诊断为 CADASIL 的 4 例先证者、来自 3 个家系 10 例患者及4 例无类似临床表现成员、以及 100 名健康对照者进行 NOTCH3 基因 PCR 扩增及变性高压液相色谱分析（DHPLC）检测；对 DHPLC阳性结果进行 DNA 双向测
2、序，明确致病性突变或多态类型。结果 在 CADASIL 先证者及其家系患者中共发现 134 半胱氨酸酪氨酸（Cys134Tyr） 、141 精氨酸半胱氨酸（Arg141Cys） 、90 精氨酸半胱氨酸（Arg90Cys）3 种突变类型，存在于第 3、第 4 外显子，为杂合错义突变。同时发现 15 种多态类型。其中家系 1 和家系 2 中分别发现 1 名成员与先证者存在相同位点的 NOTCH3 基因致病性突变，尚未出现与先证者相应的临床表现，被确定为临床前期患者。结论 NOTCH3 单基因突变是 CADASIL 的分子遗传学基础，第 3、4 外显子可能是中国 CADASIL 家系的热点突变区。第
3、 4 外显子 Cys134Tyr突变类型为国内首次报告。 KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 伴皮质下梗死及白质脑病常染色体显性遗传性脑动脉病；NOTCH3 基因；突变NOTCH3 gene diagnosis in cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy TANG Xiao-mei, YANG Jing-fang, FENG Xiu-li, et al. Institute of Geriatric, Xuanwu Hospital, Capit
4、al Medical University,Beijing 100053,ChinaAbstract：Objective To analyse the mutation types of the NOTCH3 gene with cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy（CADASIL）. Methods Including 4 probands of CADASIL,10 cases of CADASIL and 4 normal members fro
5、m 3 CADASIL families and 100 healthy controls were recruited. Genomic DNA was extracted from white blood cell. The amplicons were analyzed by the denaturing high-performance liquid chromatography （DHPLC） technique. The positive samples which identified by the DHPLC were sequenced to determine the sp
6、ecific mutation or polymorphism, respectively. Results Three heterozygous missense mutations including Cys90Arg, Arg141Cys, Cys134Tyr located in the exon3 and exon4 were found in the 4 probands and 10 cases of CADASIL among the 3 families. 15 polymorphisms were also found. 2 members individual from
7、family 1 and 2 were found to carry the same pathological mutations as in their proband but without clinical symptoms. KKME-专业医学搜索引擎 http:/ were identified as preclinical patients. Conclusions Mutation detection of NOTCH3 is the molecular genetic mechanical for CADASIL. The exon3 and exon4 are possib
8、le hot mutation spots in Chinese patients. The mutation of Cys134Tyr in exon4 is a novel mutation which has not been reported previously in China.Key words：cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy；NOTCH3 gene；mutation伴皮质下梗死及白质脑病常染色体显性遗传性脑动脉病（CADASIL）
9、在中、青年脑梗死发病中的遗传因素受到重视。目前，全世界已经有超过 400 个相关 CADASIL 家系报道，大多数为白种人。国内 2000 年报道了首例家系。本研究通过对 4 例中国CADASIL 先证者及其家系进行 NOTCH3 基因研究，旨在了解相关热点基因突变区、突变类型，对临床前期患者做出基因诊断，以便了解中国 CADASIL 患者的自然病程。1 对象与方法1.1 对象1.1.1 CADASIL 先证者 系 20022003 年首都医科大学宣武医院神经内科、温州医学院附属医院、山西医科大学附属医院就诊患者，男 3 例，女 1 例；年龄 3862 岁，平均（456.8）岁。临床表现均为反
10、复缺血性卒中发作及血管性痴呆（VD） 。有明确家族史，无先兆性偏头痛发作，KKME-专业医学搜索引擎 http:/ CADASIL 家系成员组 共 14 人，男 9 人，女 5 人；年龄 2948 岁，平均（346.8）岁。6 人来自家系 1，与先证者有血缘关系 5 人，其中3 人（1、7、13）有缺血性卒中发作史，但无 VD，2 人（2、3）无临床症状;1 人无血缘关系（1） 。7 人来自家系2，6 人与先证者有血缘关系，其中 5 人（2、6、10、2、8）有与先证者相似的临床表现，1 人（7）无临床症状；1 人无血缘关系（14） 。1 人来自家系 3，与先证者有血缘关系（7） ，但无先证者
11、相似的临床表现。家系 13谱图见图 1。家系 4 未提供家系资料。1.1.3 正常对照组 系同期在首都医科大学宣武医院参加流行病学调查研究的健康查体者 100 名，男 52 名，女 48 名；年龄 5672 岁，平均（638.2）岁。无神经系统变性病史及精神病史，无脑血管病高危险因素及家族史。1.2 方法1.2.1 DNA 提取 入组者知情同意后，取肘静脉血 10 ml（枸橼酸钠抗凝） ，4保存，两周内采用分子克隆第二版介绍的方法从血液白细胞中提取 DNA。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ NOTCH3 突变检测 （1）采用聚合酶链反应（PCR）体系：总反应体积为 25 l去离子水 1
12、8.7 l， Mg2+缓冲液（15 mmol/L）2.5 l，dNTP（2.5 mmol/L）2 l，引物 F 0.5 l，引物 R 0.5 l，模板 DNA 0.5 l 及 Taq 酶 0.3 l；引物序列见表 1，其中第3、4、18、20 外显子引物序列引用相关文献6 ，余引物序列均为使用 oligo 及 DNAstar 软件自行设计。 （2）PCR 扩增的热循环条件如下：95预变性 5 min；95，30 s, 第 2 外显子（60 ，45 s） ；第 3 外显子（57，45 s） ；第 4 外显子（58，45 s） ；第 5 22外显子（60 ，45 s） ；第 23 外显子（59，4
13、5 s） ，72，70 s，35 个循环； 72延伸 10 min。 （3）取 5 l PCR 产物加入 0.5 l 上样缓冲液，进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压为 120 V，30 min后观察结果，出现相应长度的单一 PCR 扩增条带，认为扩增成功，待变性高压液相色谱分析（DHPLC）检测。 （4）DHPLC 检测条件：23 l 的 PCR 产物被流动相为 0.9 ml/min 的速度带至 DNA 分离柱而得以分离，分析一个样品需要 810 min。对经 DHPLC 检测为单峰的 PCR 产物调整柱温，调整范围在 13，以观察峰形变化。分别选取 CADASIL 组及正常对照组突变峰型及正
14、常单峰进行二次PCR 扩增，送至上海生工生物工程技术服务有限公司，使用美国ABI 公司 377 机型进行双向测序，确定致病性突变、多态及野生型基因序列。表 1 外显子引物序列及产物片段大小（略）2 结 果KKME-专业医学搜索引擎 http:/ NOTCH3 基因致病性突变及多态类型 见表 2 及图 24。4 例先证者及其家系中共发现 3 种致病性突变，分别位于外显子 3 及 4 中。家系 2 中所有发病者及 1 名未发病者出现与先证者相同的基因突变。家系 1 中所有发病者及 1 名未发病者出现与先证者相同的基因突变。表 2 先证者及其家系成员 NOTCH3 基因致病性突变类型（略）2.2 C
15、ADASIL 先证者及其家系成员中 NOTCH3 基因多态性类型 见表 3。4 例先证者及其家系中共发现 NOTCH3 基因 15 种多态类型。表 3 先证者及家系成员 NOTCH3 基因多态类型（略）3 讨 论1977 年 Sourander 等1首先报道了 1 个 CADASIL 家族，称之为遗传性多梗死性痴呆；1993 年 Tournier-Lasserve 等2将致病基因定位于 19 号常染色体；1996 年进一步定位为 NOTCH3 基因3 。NOTCH3 基因编码含有 2321 个氨基酸的跨膜受体蛋白，其细胞外区包含 34 个表皮样生长因子重复序列（EGF-like） ，每个EGF-like 包含 6 个高度保守的半胱氨酸残基，并形成 3 个二硫键。正常组织中，NOTCH3 基因的表达严格限于血管平滑肌细胞。NOTCH3 基因致病性突变导致 EGF 序列半胱氨酸残基数量的奇数化，破坏了规范的二硫键的配对，导致血管平滑肌细胞功能异常而致病4，5 。CADASIL 是系统性动脉疾病，但首先表现为脑部症状，其病理生理基础主要依赖于一些特殊的脑血管构筑特征和循环模式。血管平滑
