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1、犬腺病毒分子流行病学调查范泉水1 邱薇2 李作生1 王双印1 剡海涛2 夏威t t l 成都军区联勤部军事医学研宛所2 辽宁省公安厅警犬基地3 解放军军事医学科学院军事尊医研究所犬腺病毒( c a n l n e a t J e n o v i m s 。o v ) 是在业已发现的哺乳动物腺病毒属中致病性最强、形 态结构也研究得较为清楚的一种动物病毒叮其1 型( C W 一1 ) 腺病毒是引起犬传染性肝炎和熊、狐脑炎的病原犬2 型腺病毒( c A v 一2 ) 主要感染小狗导致传染性喉气管炎和肠炎。我们通过对与犬腺病毒毒力、细胞亲嗜性、抗原性相关的纤突基因的序列分析来研究我国犬腺病毒的变异情况
2、和规律，以探索我国流行强毒株与国外毒株相比的变异情况，现报告如下：l 材料与方法1 1 病毒及病料：犬1 型腺病毒有以下强毒株：l 、长春犬株C C C V 6 ；2 、昆明犬株K M CV 4 ：3 、占林狐狸株J L F V 7 ；4 、云南熊株Y N B ；5 、云南犬肝Y l q L ；6 、江西犬肝J X C L ；7 南京犬肺N J C L ；8 成都犬肝皿忸。犬2 型腺病毒有以下毒株：1 、沈阳分离株S Y V 5 ：2 、美国疫苗毒。U S V 2 0 ；3 、哈尔滨犬鼻分泌物H E C S ；4 、南宁警犬肺I 哪C L ；5 、云南犬肺Y N C L 。】2 引物：我们分析
3、了c , e r m a n k 中已有的C A V 的纤突基因序列，选择纤突基冈两侧及中间相对保守区。利用分子生物学计算机软件G O L D K E Y 设计合成了4 对8 条引物扩增C A V的纤突基因，详见表l 。表h 计算机合成的C A V 两个型纤突基因引物1 3P c R 反应：取2 u l 细胞培养液，加入船社1 扩增反应液( 0 2 r e t o o l 1d A 丁P ，d G T P ，d C T P 和d T r P ：5 0 m m o l L K C l ；2 5 m 砌I M 目c 】2 ；1 0 m m o l L T r i s H C I ；P H 8 3
4、室温) ：0 0 1 明胶：上游引物l u r m l L ，h 游引物l u m a t L ；0 0 3 U p l T a q 酶) 。P C R 反应条件为：9 6 C 变性5 0 S ，5 2 退灭6 0 S 7 2 C 延什6 0 S 。共3 5 个循环。扩增产物经1 5 琼脂糖凝胶电泳检测。P c R 使用的引物配对是P 1 一P 2 、P 3 一P 4 。1 4 P C R 产物测序和犬腺病毒纤突基因的序列分析：按购自日本宝生物：h 程( 人连) 公司的P C R F m g r a e n tR e e o v e r y K i t 试剂盒使用说明书进行P C R 产物的纯
5、化。由E l 本宝生物工程( 大连) 公司完成序列测定。应用G O L D K E Y 、D N A S I S 和P R O S I S 等分子生物学软件对扩增的纤突蛋白基因的测序结果进行了分析。】7 52 结果2 1P C R 扩增结果用引物P l P 2 、P 3 一P 4 、对c A V 一1 株的M D C K 细胞培养物及脏器进行扩增，均得到了阳性扩增结果，扩增片段的理论值分别为9 6 6 、8 5 8 ；用引物P 5 一P 6 和P ?一P 8 对C A V 一2 株的M D C K 细胞培养物及病料进行扩增，均得到了阳性扩增结果，扩增片段的理论值分别为9 4 8 利9 1 2
6、b p ( 虬图1 ) 。l23451 ： D N A ( 叫+ F 址o m ) M a r k c 。；2 5 ：4 对引物的P C R 扩增结果P 7 - 礴引物；3 ：P 5 一P 6 P C R 结果；4 ：P 3 一P 4 F C R 结果；5 ：P I P 2 , P C R 结果1 ：xD N A ( H 抽d 1 l + E m ) M a r k c x ；2 5 ：P C R0 f t h e 4p 曲dp I i r n 口圈1C A V 一1 和C A V 一2 的P O t 扩增结果F k 1P C R d c A V 一1a n dC A V 一22 2V A V
7、 一1 纤突蛋白基因的序列测定与比较结果用C O L D K E Y 软件将C A V 一1 的P C R 片段所测序列拼接后，得到了个由1 6 3 2 个核苷酸组成的纤突蛋白的基因序列，编码5 4 3 个氨基酸。根据纤突基因测序结果与由M o r r i s o n 测定的犬C A V l 砒2 6 1 株的纤突蛋白氨基酸序列的比较结果详见表2 。表2 ：C A V 一1 纤突蛋白氨基酸序列比较结果T a b l e2C o m p a r i s o no fa m i n oa c i d so ff i b e rp m t o i no fC A V 一12 1 位9 7 位1 3
8、1 位2 0 6 位2 2 1 位3 0 1 位3 1 1 位3 7 6 位3 9 2 位R 1 2 6 lPYNPVRTTRC C C 一、埒QYKSARTARK M C V 4PRNSVSAAR J L F 一PYKPARTTSY N B 一、，5PRNPVSTTSY N LPYNSVSTTRJ X C LQRNSVRAARN J C LPRKPARTTSC D C LOYNPVSTTS2 3C A V 一2 纤突蛋白基因的序列测定与比较结果C A V 一2 纤突蛋白的全基因序列由1 6 3 2 个核苷酸组成，编码5 4 3 个氨基酸。测定与推导的序列与C , e n B a n k 中的
9、T o r o n t oA 2 6 6 1标准的C A V 一2 强毒株纤突蛋白基因推导的氨基酸序列比较结果见表3 。1 7 6表3 ：C A V 一2 纤突蛋白氨基酸序列比较结果T a b l e30 m 乎a r i 8 啪o fe m a i n oa c i d so ft S t b e rp r o t e i no fC A V 一21 8 2 位2 9 8 位3 1 1 位3 1 2 位3 7 9 位3 9 2 位5 4 0 位5 4 3 位T ( r n m t oTAVGNRGSU S v 2 0ISASKIFDs Y 一、巧TAVGNRGSH E C SIAVGNRGS
10、N N C LTAVGNRFSY N C LIAVGNRGS3 讨论C A V 一1 除能感染狐和狗外，还能感染狼、貉、山狗、黑熊、负鼠和臭鼬，其中狗、山狗、狼、貉、负鼠和臭鼬主要表现肝炎症状，而狐狸和黑熊主要表现脑炎变化。自从1 9 2 5 年G r e e n 首次发现狐脑炎、1 9 4 7 年R u b a h 证实犬传染性肝炎以后，有关该病毒引起狗和狐的发病病例举不胜数，日前世界上各个国家和地区都有该病的报道。貉感染本病毒的报道也较多，钟志宏等人也曾进行过实验感染，发现其l | 缶床症状利病理变化与狗相似，主要是肝脏受损。S h o r i d g e 等人通过血清学调查认为马、兔子、
11、松鼠、刺猬和黑猩猩也是犬腙病毒的敏感动物。1 9 9 4 年血k a 等人对卧龙自然保护区的大熊猫进行了C A V 体凋杏，发现C A V 也能使大熊猫发生感染。人群中抗体阳性率也很高( 3 5 人兽医人员更高( 4 9 ) ，而且也能检山补反抗原，但不表现任何症状，由此可知人也能隐性感染本病毒。一般认为C A V 一2只能感染犬科动物导致呼吸道疾病和腹泻。1 9 8 8 年J o h n 在进行1 2 服免疫试验时发现C , A V一2 也能使貉、狐等犬科动物及黑熊、浣熊不表现 旌床症状仅有轻度解剖病变的感染，但能产生高效价的C A V 中和抗体，从腺病毒的进化分析来看，E V A 一1 的
12、动物感染宿主在不断扩大，这也许与变异有关，C A V 一2 可能就是C A V l 进化而来的。从犬c N l 的标准强毒R 12 6 1 株的纤突蛋白基因序列的比较结果表明：l 、我国流行的c 、k 一1 株与M o r r i s o n 测定的犬E A V 一1 的标准强毒R 12 6 1 株，差异相对较大，而互相之间相对差别较小。c 、。_ 2 比较结果表明美国疫苗毒株U S V 2 0 与我国流行的强毒株差异较大有U 一1 0 个碱基发生变 化，但我国流行的c v 1 之间变化不大。美国疫苗毒株U S 一2 0 与T o r o n t o 株与我们测定的其它毒株变化的碱基导致8 个
13、氨基酸的变异。从C A V 一1 与C A r 一2 的纤突基因比较来看C A V 一1 纤突的变异相对较大。C A V 一2 变异较小。与国外毒株差异较人而我国之间相对较小，我们仍然没有发现他们之间的关系，这可能与我们调查的例数较少有关。参考文献 1 殷震，刘景华，主编动物病毒学 M 第2 版北京：科学出版社，1 9 9 7 1 1 0 4 ，1 1 3 0 2 夏成柱钟志宏林青年等犬传染性肝炎病原、诊断与实验免疫研究中国畜禽传染病川，1 9 9 0 ，6 ：3 8 4 0 3 钟志宏夏咸柱范泉水等狐狸脑炎病毒的分离鉴定和流行病学调查兽医大学学报t 1 ) ，1 9 9 0 ，1 0 ( 2
14、 ) ：1 1 1 1 1 6 4 范泉水齐桂凤王度林等熊脑炎病毒的分离鉴定中国畜禽传染病( J ) ，1 9 9 4 ，1 ：2 4 1 7 7 5 W a n g o l 2 ，W o o d i n gW LJ r ，B i r mL N Ae o m p a l i l l0 ft h ep a t h o g e n e s i s a n d 枷鲫i d t yo f “f e c t i o u sc a n i n eh e P a f i t i s v i m sa n dt h eA 2 6 6 1v i r e sS t l “ a i n ( T m o n t o
15、) JA mV e tM e d A s s o c m 1 9 7 0 J u n l 5 ：1 5 6 ( 1 2 ) ：1 6 8 7 9 6 6 F a i r c h i l d G A C m m m n t s O n i n f e c t i o u se a n i n d a e p a t i f i sa n d T o a t o A 2 6 6 1v i r u s J A m V e tM e d A s s o e I l L1 9 7 0J u n1 5 ：1 5 6 ( 1 2 ) ：1 6 9 7 9 7 A p p d M ，B e m i s D A T h e e a n i n e e o m g i o u s r e s p L , a t o x y d i s e a s e e o 唧l e x ( k e n n d e o u g h ) C o m e U V e t川1 9 7 8 J m ：6 8 S l l p p l7 ：7 0 5 8 P o w d l K W U O f e a n i n e a d e m v i m s t y p eS f l 】 n h n c I i n ( J 1 1 9 7 9J u n ；7 4 ( 6 ) ：8 0 1 4 1 7 8
