《抑制血管平滑肌细胞增殖相关基因的筛选克隆定位与功能研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抑制血管平滑肌细胞增殖相关基因的筛选克隆定位与功能研究（114页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国协和医科大学博士学位论文抑制血管平滑肌细胞增殖相关基因的筛选克隆定位与功能研究姓名：刘舒申请学位级别：博士专业：病理与病理生理指导教师：孙仁宇20050501中国协和医科大学中国医学科学院博士学位论文A 【JA m pA P SA SB C AB C I PB U NC B Bc D N AD aD A BD D P C RD E P CD M S oD N Ad N T PD T TE BE c o l iE D T AF B SI P T GK a n aM D A英文缩略语表a l a n i n ea m i n o t r a n s f 色r a s eA m p j c i
2、l “nA m m o n i u mp e r s u l f a t eA r t h e r o s c l e r o s i sB i c i n c h o n i n i ca c i d5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 一i n d o l y l p h o s p h o r i ca c i db l o o du r i an i t r o g e nC o o m a s s i eb r i l l i a I l tb l u ec o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c
3、 l e i ca c i dD a i d z e i np - d i m e t h y l a m i n o a z o b e n z e n eD i f 五踟陀n t i a ld i s p l a yP C Rd i e t h lp y r O c a r b o n a t ed i m a t h y ls u l f - o x i d ed e o x y r i b o n u c l e i ca c i dd e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h O s p h a t eD i t h i o t h r
4、 e i t o lE t h i d i u mb r o m i d eE s c h e r i c h i ae t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i dF e t a lb o v i n es e m mi s o p r o p y l t h i o p - D g a l a c t o s i d eK a n a m y c i nM a l o n d i a l d e h y d e一3 一丙氨酸氨基转移酶氨苄青霉素过硫酸铵动脉粥样硬化二辛可酸5 溴4 氯3 吲哚磷酸尿素氮考马斯亮蓝互补脱氧核
5、糖核酸大豆甙元对二甲胺基偶氮苯差异显示P C R焦磷酸二乙酯二甲基硫氧化物脱氧核糖核酸脱氧核糖核营三磷酸二硫苏糖醇溴化乙锭大肠杆菌乙二胺四乙酸胎牛血清异丙基硫代一B D - 半乳糖苷卡那霉素丙二醛! 里堡塑堕型查兰生里堕兰型兰堕堡主兰堕丝塞 M O P s3 一m o r p h o l i n o p r o p a n e s u l f o n i ca c i d3 一吗啉基丙磺酸m R N AM T TN B TN Oo R FP A G EP C RP T C AP E GP uR Sr t P C RS D SS M C sT CT E M E DT b t r aT GT r
6、i sX g a lm e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d3 一【4 ，5 d i m e t h y l t h i a z o l z y l 】- 2 ，5 一d i p h e n y lt e t r a z o d i u mb r i o m i d en l t l 0 b l u et e t r a z o l i u mn i t r i co x i d eo p e nr e a d i n gf a m ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e
7、 s i sp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np e r c u t a n e o u st r a n s l u m i n a lc o r o n a r ya n g i o p l a s t yP o l y e t h y l e n eP u e r a r i nR e s t e n o s i sR e V e r s et r a n s c r i p tP C Rs o d i u md o d e c y ls u l f 乱es m O O t hm u s c l ec e l l st o t a lc
8、 h O l e s t e r o lN ，N ，N ，N 一t e t r am e t h y le t h yl e n ed i a m i n eT c t r a c y c l i n eT r i g l y c e f i d e1 r i s ( h y d r o x y m e m y l ) a m i n o m e t h a n e5 b r o m i d e 4 c h I o r o 3 i n d o- D D g a l a c t o s i d e信使核糖核酸3 - f 4 ，5 一二甲基噻唑- 2 ) - 2 ，5 二苯基四氮唑溴盐四唑氮蓝一氧
9、化氮开放阅读框聚丙烯酰胺胶电泳聚合酶链反应经皮冠状动脉腔内成型术聚乙烯二醇葛根素再狭窄逆转录P C R十二烷基硫酸钠平滑肌细胞总胆固醇N ，N ，N ，N ，四甲基乙烯二胺四环素甘油三酯三羟甲基氨基甲烷5 澳一4 氯3 吲哚一B - D - 半乳糖苷中国协和医科大学L | 国医学科学院博士学位论文技术路线示意图第五部分 ( 目的：探讨可能诱导途径)5 一中国协和医科大学中国医学科学院博士学位论文抑制血管平滑肌细胞增殖相关基因的筛选克隆定位及功能研究一、研究背景与目的中文摘要心血管病是严重危害人类健康的第一杀手。血管平滑肌细胞( v a s c u l a rs m o o t hm u s c
10、 l ec e l l ，V s M c ) 增殖和迁移是经皮冠脉腔内血管成形术( p e r c u t a n e o u st r a n s l u m i n a lc o r o n a r ya n g i o p l a s t ，P T c A ) 及支架植入术后再狭窄、动脉粥样硬化( A t h e r o s c l e r o s i s ，A s ) 、高血压等疾病的病理基础之一，抗增殖治疗是目前心血管领域研究的热点。本研究以血管平滑肌细胞为研究对象，以大豆甙元为( d a i d z e i n ，D a ) 工具药，以大豆甙元抑制血管平滑肌细胞增殖的相关基因为切入
11、点，寻找能够抑制血管损伤后内膜v s M c 过度增殖的基因及其编码蛋白，并探讨其作用机制，以期为心血管疾病的防治提供理论和实验依据。二、材料与方法1 体外细胞实验确定大豆甙元对血管平滑肌细胞增殖抑制作用的最佳药物作用浓度及时间，D D P C R 差异筛选大豆甙元抑制v S M C 增殖的相关基因。2 筛选出的E s T ( e x p r e s s i o ns e q u e n c et a g ) 进行同源性、结构域分析，竞争性反转录P c R 验证，确定药物诱导效果最明显的c D N A 片段。3 复制大鼠颈动脉球囊损伤动物模型，损伤当天起每曰清晨给大鼠腹腔内注射大豆甙元干预(
12、2 0 0 M k g d ) ，对照组给予同体积溶剂，每组各8 只。给药5 周后病理切片、血清生化指标分析，并对大鼠颈动脉球囊损伤后的病理切片进行基因表达的组织定位。4 根据验证阳性的基因编码序列获得编码区c D N A 连接于表达载体p E T 3 2 a ，6 ! 鬯堡塑堕型茎兰主里垦兰翌兰堕堕主堂垡堡兰构建表达重组子，转化入O “g a m i ( D E 3 ) ，诱导蛋白表达、酶切、纯化并鉴定。蛋白纯化后免疫家兔，提取多克隆抗体，对雌激素和大豆甙元刺激后的细胞爬片进行免疫组化进行细胞定位、病理切片的组织定位。5 采用B o y d e n 小室法测定蛋白和大豆甙元对细胞迁移的作用，
13、并测定蛋白对细胞活性的影响，并分析经蛋白刺激后细胞周期的变化。6 不同来源的血管平滑肌细胞给予药物刺激及拮抗剂阻断，竞争性反转录P C R 、N o n h e mB l o t 、原位杂交验证探讨大豆甙元诱导目的基因表达的作用途径。三、结果1 差异筛选相关基因：体外细胞实验显示l x l O 西M l x l 0 4 MD a 作用2 4 h 可显著抑制人脐动脉平滑肌细胞增殖。以溶剂对照、l x l 0 。6 MD a 和2 5 x l O 5 MD a刺激细胞后进行D D P C R 分析。结果显示1 1 个E s T 片段于高浓度组( 2 5 x 1 0 5 MD a ) 强，低浓度组(
14、 1 x 1 0 6 M ) 弱，对照组最弱；4 个E S T 片段低浓度组强，高浓度组弱，对照组最弱；4 个E s T 片段对照组强，低浓度组弱，而高浓度组最弱的片段。2 体外验证与同源分析：竞争性反转录P c R 证实了D a 对有3 个编码奢侈基因克隆( H 3 A 、H 6 A 和C 2 B ) 的诱导作用，其中大豆甙元对H 3 A 的诱导作用最强。H 3 A 序列与名为F S T L l 的基因相似性为1 0 0 ；H 6 A 序列与K I A A 0 6 6 3 的基因相似性为8 6 ；c 2 B 序列与K I A A l 2 6 5 的基因相似性为9 4 。3 目的基因体内验证：
15、大豆甙元干预后可显著抑制球囊损伤后的内膜增殖，病理图像分析：与溶剂对照组相比，治疗组管腔面积显著增加( 2 4 4 1 0 8 士1 7 6 5 1v s6 9 1 5 7 士2 0 7 0 8u m 2 ，P 1 8 时使用。3 免疫组化进行蛋白定位3 1 细胞爬片进行免疫组化将载玻片置于2 4 孔板内，并把乳内动脉v s M c 细胞接种到载玻片上，每孔接种2 万细胞，继续培养，待长满到6 0 时开始实验。分三组，对照组( 加入无血清培养基，D M E M ) ，低浓度组( 加入无血清培养基和5 “MD a ) 和高浓度组( 加入无血清培养基和2 5 MD a ) ，l x l 0 7 M
16、 雌二醇作为阳性对照分别刺激2 4 h ，之后分别加入1 0 去除激素的胎牛斑清培养基，并在低浓度组加入5 MD a 和高浓度组( 加入无血清培养基和2 5 M D a ) ，分别刺激2 4 h ，之后分别加入1 0 去除激素的胎牛血清培养基，并在低浓度组加入5 u M D a ，高浓度组2 5 u M D a ，阳性对照组1 x 1 0 7 M 雌二醇继续刺激2 4 h ，然后行用多抗进行免疫组化实验。树胶封片后4 0 0 倍光镜观察。3 2 病理切片进行免疫组化取球囊损伤大鼠颈动脉手术对照组、D a 治疗组石蜡切片脱蜡后免疫组化染色。方法同前。一! 里堕塑堕型查兰旦垦兰型堂堕堡主兰垡丝苎( 五) 目的蛋白对细胞功能的影响1M T T 法测定目的蛋白对V S M C 活性的影响于9 6 孔板内接种乳内动脉V S M C5 0 0 0 细胞孔，培养液为D M E M 培养基加2 0 胎牛血清。待长满8 0 后
