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1、2 0 0 6 年全国儿科热点研讨会论文集E V T l 嗜皮肤性和嗜神经性分离株与 三种不同组织来源细胞系亲嗜性的初步研究方焕生，姚英民谢健屏，赖桂香( 解放军3 0 6 医院儿科，北京1 0 0 0 0 )肠道病毒7 l 型( E V 7 1 ) 是小R N A 病毒科肠道病毒属成员，可引起手足口病( H F M D ) 、脑干脑炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹、疱疹性咽峡炎、神经源性肺水肿、肺出血、病毒性心肌炎等多种疾病。自从1 9 7 4 年S c h m i & 等人首次报道从美国加利福利亚表现为神经系统疾病的患者中分离到E v 7 1 ，E V 7 1 已在世界范围内引起十多次爆
2、发和流行，导致了数十万名儿童感染，有数千人死亡。拉3 1 上世纪9 0 年代后期，E v 7 1开始肆虐东亚与东南亚地区，日本、马来西亚、新加坡以及我国香港、台湾、大陆等地区陆续报道了E V 7 1 感染。【4 5 根据病毒衣壳蛋白V P l 核苷酸序列的差异，可将E V 7 1 分为三个基因型：A 、B 和c 型。L 6 ，7 副目前E V 7 1 感染仍然是全球威胁性较大的病毒性疾病之一，尤其在东南亚其危险性更大，但到目前为止，病毒的变异较大，其不同型别或同一型别在不同时间、不同地区乃至不同个体引起了不同的临床表现，E V 7 1 众多的病毒型别是怎么形成的，其基因组测序的结构的差别和病毒
3、功能的关系是什么尚不清楚。令人担忧的是E V T l 具有比脊髓灰质炎病毒更广泛的神经毒性，中枢神经系统受累是其感染的严重并发症，可导致死亡，但导致神经毒性与病毒基因型的确切关系尚不清楚。11材料和方法1 1 细胞株和研究对象入神经母细胞瘤细胞( S K N S H ) 购自中国科学院上海细胞生物研究所，非洲绿猴肾细胞( V e r o ) 、人喉鳞状细胞癌细胞( H e p 4 ) 由广州市儿童医院病毒室提供。2 0 0 4 年从手足口病患者标本分离到的已知序列E V 7 l 病毒0 4 H 1 0 0 、0 4 H 1 2 1 、0 4 H 1 1 9 、0 4 H 1 0 6 ；2 0
4、0 1 年从神经系统受累患者标本分离到的已知序列E V 7 1 病毒0 1 H 6 9 、0 1 H 9 8O L 9J1 2 实验方法首先用微量培养法滴定各病毒株的5 0 组织细胞感染量( T C I D 5 0 ) 。购回的S K N S H 细胞生长至8 0 9 0 单层融合状态时，弃去原培养液，P B S 冲洗2 遍，用0 2 5 胰酶( 天象人生物工程有限公司) + 0 0 2 E D T A ( 1 ：1 ) ( S i g m a 公司) 消化约2m i n ，在倒置显微镜下观察，见细胞质回缩，胞体趋于变圆，细胞间隙变大时，弃去消化液终止消化，加入p H7 4 含1 0 小牛血清
5、( 杭州四季青 公司) 的R P M I1 6 4 0 ( G i B C O 公司) 培养基，反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之脱落形成细胞悬液，按l ：2 比例分装到2 5 c m 2 细胞培养瓶( C o m t a r 公司) 内，放于3 7 。C 、5 C O ：培养箱内培养。当各培养瓶的s K N S H 、V e r o 、H e p 4 细胞生长至8 0 一9 0 单层融合状态时，弃去原培养液，P B S 冲洗2 遍，用0 2 5 胰酶消化约1m i n ， 在倒置显微镜下观察，见细胞质回缩，胞体趋于变圆，细胞间隙变大时，弃去消化液终止消化，1 20 0 0r p m 离心5m i n
6、 收集细胞，再用p H7 4 含1 0 小牛血清的R P M I1 6 4 0 培养液稀释，等量接种于9 6 孔培养板，每板接种3 种细胞各3 2 孔，共接种2 板，放于3 7 、5 C O ：培养箱内培养，2 、3d 后细胞可长满培养孔。镜下进行细胞计数和细胞活力检测后，准备进行病毒接种。6 个病毒株均以1 0 0 个T C I D 5 0 病毒按常规方法进行接种，每个病毒株接种3 种细胞系( 1 0 5 c e n s m L ) 的各8 孔。从接种后2 4 小时起开始观测C P E ，共观测2 天，并照相。在接种病毒后的1 2h ，2 4h ，3 6h ，4 8h 进行实时定量荧光P C
7、 R ，计算病毒的拷贝数，以检测病毒在细胞中的复制。【1 训病毒R N A 的提取：从接种后1 2h 、2 4h 、3 6h 和4 8h 共进行4 次R N A 的提取，每次提取4 29 5 2 0 0 6 年全国儿科热点研讨会论文集孔，即6 个病毒株的每种细胞系各2 孔，每种细胞的阴性对照各2 孔，每孔均采1 0 0I x L 细胞反复冻融3 次后，每个病毒株每种细胞各2 0 0 u l 进行R N A 提取。实时定量荧光P C R ：以T r i z o l 抽提样本的总R N A 后，先按第一部份进行逆转录，荧光探针5 F A M A G A T C T A T C T C C C C
8、T A c C A AG C C T G C C C T R O X 37 ( 上海申友生物技术公司设计及合成) ，然后把e D N A 转入反应管放人实时荧光定量P C R A B l 7 0 0 0 ( 美国应用生物系统公司) ，以乙肝标准病毒株为标准样本，进行P C R ，扩增条件如下：预变性9 4 2m i n ，然后9 4 3 0s ，5 0o C3 0s ，共4 0 个循环。反应结束，由电脑自动分析计算出定量结果。1 3 统计方法用S P S S l 0 0 P C 软件包分析检测结果，病毒株在各细胞中病毒拷贝数采用随机单位组设计资料的方差分析，检验水准0 【= 0 0 5 。2
9、结果2 1 病毒滴定各病毒株的T C I D 5 0 ( 1 0 0l x L ) 结果：0 4 H 1 0 0 为1 0 毛6 2 ，0 4 H 1 2 1 为1 0 矗6 8 ，0 4 H 1 1 9 为1 0 矗3 0 ，0 4 H 1 0 6 为1 0 曩4 5 ，0 1 H 6 9 为1 0 矗8 1 ，0 1 I - 1 9 8 为1 0 7 6 7 。 2 2 病毒株接种各细胞系后的C P E 比较六个病毒株2 4 h 、4 8 h 在S K N S H 和V e r o 细胞均发现严重C P E ，六个病毒株之间、两种细胞系之间无明显差异，而在H e p - 2 细胞系则明显较
10、轻。2 3 实时定量荧光P C R 定量检测各细胞系中的病毒复制及生长曲线手足E l 病病毒株接种V e r o1 2h ，2 4 h ，3 6 h ，4 8h 后其平均病毒拷贝数分别为1 0 3 、1 0 5 、l O7 。9 1 、1 09 。7 2 ，神经系统感染病毒株接种V e r o1 2h ，2 4h ，3 6h ，4 8h 后其平均病毒拷贝数分别为1 0 3 、1 0 5 、1 0 7 、l O 吼9 4 ，两种临床类型病毒株在V e r o 细胞中病毒复制量无明显差异( P O 0 5 ) 。手足口病病毒株接种S K N S H1 2h ，2 4h ，3 6h ，4 8h 后其
11、平均病毒拷贝数分别为1 0 3 8 7 、1 0 5 8 9 - , 1 0 7 9 1 、1 0 吼7 2 ，神经系统感染病毒株接种S K N S H1 2h ，2 4h ，3 6 h ，4 8h 后其平均病毒拷贝数分别为1 0 3 、1 0 5 、1 0 7 船、1 09 9 4 ，两种临床类型病毒株在S K N S H 细胞中病毒复制量无明显差异( P 0 0 5 ) 。手足口病病毒株接种H e p - 21 2h ，2 4 h ，3 6 h ，4 8h 后其平均病毒拷贝数分别为1 0 3 、1 0 5 、1 0 7 9 1 、1 0 9 17 2 ，神经系统感染病毒株接种H e p -
12、 21 2h ，2 4h ，3 6h ，4 8h 后其平均病毒拷贝数分别为1 0 3 、1 0 5 一、1 0 t 镐、1 09 9 4 ，两种临床类型病毒株在H e p - 2 细胞中病毒复制量无明显差异( P 0 0 5 ) 。两种临床类型病毒株在S K N S H 和V e r o 病毒复制量均明显较H e p - 2 显著( P 0 0 5 ) 。3 讨论自1 9 7 4 年首次报道在美国爆发新型肠道病毒7 l 型后，全球范围内约发生了1 5 次大流行，在不同时间和不同地区流行所引起的临床症状是多种多样的( 手足口病、脑炎、类似于小儿麻痹症候群和神经性肺水肿等) 。E V 7 1 感染
13、的患) L 7 9 发生手足口病，3 1 发生高热，但病情均轻微，病程有自限性，在手足口病皮疹出现后2 4d ，约有1 2 一8 0 的病例发生中枢神经系统并发症，均以1 岁以内的婴幼儿最多见。E V 7 1 具有比脊髓灰质炎病毒更广泛的神经毒性，中枢神经系统受累是其感染的严重并发症，可导致死亡或永久性肌麻痹，主要有无菌性脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、脊髓灰质炎样肌麻痹、格林一巴利综合征等。在脊髓灰质炎病毒近乎从人类疾病中根除的今天，新型肠道病毒的危害性显得尤为重要。在一般情况下，E V T l 病毒在靶细胞中增殖，产生溶解性感染，细胞受到损伤以致完全破坏；靶器官出现继发性炎症，在感染局部和血管周围
14、有明显细胞浸润，主要为淋巴细胞，伴有中性粒细胞、浆细胞等。E V 7 1 常用接种细胞系有：M R C - 5 ( 人胚肺成纤维细胞) ，V e r o ( 非洲绿猴肾细胞) ，R D 一1 8 s ( 恶性胚胎横纹肌瘤细胞) ，L L C M K 2 ( 恒河猴肾细胞) ，H e L a ( 人宫颈癌细胞) ，M D C K ( 狗肾细胞) 。S h i n o h a r aM 等报道，M R C - 5 分离率可达7 3 7 ，其次为V e r o5 2 6 ，L L C M K 24 7 4 R D 一1 8 s2 6 3 旧1 。而人神经母细胞瘤细胞株( s K N - s H )
15、、人喉鳞状细胞癌细胞株( H e p - 2 ) 、9 6 2 0 0 6 年全国儿科热点研讨会论文集非洲绿猴肾细胞( V e t o ) 代表不同组织来源的细胞系，尤其人神经母细胞瘤细胞株( s K N s H ) 常被用于神经系统及肿瘤研究。 1 1 1本实验结果显示：六个病毒株在三种不同组织来源的细胞系中均有复制，进一步证实E V 7 1 具有泛嗜性的特性，可以侵袭不同的器官和组织细胞，导致众多的临床类型，但对不同组织来源的细胞株亲嗜性和细胞损伤的程度明显不同，表明E V 7 1 对组织的易感性和亲嗜性有强弱之分，这与E V 7 1 轻重不一的临床表现是一致的；发现广州地区分离的嗜神经毒
16、性E V 7 1 病毒株对人神经母细胞瘤细胞( s K N s i t ) 与非洲绿猴肾细胞( V e r o ) 具有相同的亲嗜性和细胞损伤性，此结果与台湾的研究结果有所不同，他们发现当地脑炎分离株在S K N S H 中比在V e r o 中病毒相关病理反应更严重，复制速度更快；在透射电镜下可见病毒颗粒的复制、成熟病毒存在及释放；还发现神经元细胞生长因子受体基因被特异地上调，提示受体与细胞趋向性相关。 I 广州与台湾两地的研究结果有差异，可能的解释是台湾的脑炎分离株其毒力可能较广州地区分离噬脊髓神经性毒株毒力更强，这一发现与台湾暴发流行中枢神经系统重症患者较多，而广州地区散发流行轻症患者较多的流行学特征是一致的。本研究还发现广州地区基因亚型相同，临床类型完全不同( 强噬皮肤性和噬脊髓神经性) 的毒株，对人神经细胞株( S K N
