《C、N、P、S循环主要相关酶酶活测定 (2)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《C、N、P、S循环主要相关酶酶活测定 (2)（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、- 1 -C、N、P、S 循环主要相关酶酶活测定循环主要相关酶酶活测定林叶春2010-01-05A. 芳基酰胺酶芳基酰胺酶(Arylamidase，EC3.4.11.2) 1g 土样土样-试剂试剂： 0.1M pH8.0Tris 缓冲液2.44g 三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷溶于 50ml 去离子水去离子水中，用 0.05M H2SO4调节 pH 至 8.0，再用去离子水定容至 200ml；0.05M H2SO4；L-亮氨酸-萘胺溶液称取0.2342g L-亮氨酸亮氨酸-萘胺盐酸盐萘胺盐酸盐溶于适量去离子水中，并定容至 100ml，即为 8.0mM 溶液；盐酸化乙醇将 4.32ml 浓盐酸
2、浓盐酸加入到适量 95%的乙醇的乙醇中，并用乙醇定容至 200ml，即为盐酸化乙醇；4-二甲基氨二甲基氨基肉桂醛基肉桂醛(CAS:6203-18-5)溶液称取 0.12g 4-二甲基氨基肉桂醛溶于 95%乙醇中，并用乙醇定容至200ml，即为 0.6mg/ml 的溶液；-萘胺萘胺标准溶液称取 12.5mg -萘胺于 100ml 容量瓶中，加入 5ml 乙醇和 75ml 去离子水，充分摇匀，再用去离子水定容至 100ml，即为 125g/ml 的 -萘胺标准溶液。-仪器仪器：分光光度计(540nm)；25ml 三角瓶三角瓶；摇床；培养箱；离心机；试管-操作操作：取 1.0g 新鲜土壤(2mm)于
3、 25ml 三角瓶中，加入 3ml 0.1M pH8.0 Tris 缓冲液和1ml 8.0mM L-亮氨酸-萘胺溶液，盖上瓶塞，充分混匀，于 37培养 1h，再加入 6ml 95%乙醇，混匀。将上述悬液转移至离心管中，17000g 离心 1min，将上清液转移至试管中。取此上清液 1ml 于另一支试管中，加入 1ml 乙醇、2ml 盐酸化乙醇和 2ml 4-二甲基氨基肉桂醛溶液，充分混匀，于 540nm 处比色测定。对照样，在培养结束之后再加入 1ml8.0mM L-亮氨酸-萘胺溶液。-校准曲线制作校准曲线制作：分别量取 1，2，3，4，5 和 6 ml 125g/ml -萘胺标准溶液于 25
4、ml 的容量瓶中，用去离子水定容，即得 5，10，15，20，25 和 30g/ml -萘胺工作溶液。取上述工作液各 1ml 于试管中，分别加入 1ml95%乙醇、2ml 盐酸化乙醇和 2ml 4-二甲基氨基肉桂醛溶液，摇匀后于 540nm 处比色。 -结果结果： 芳基酰胺酶活性(g -萘胺g-1h-1) = CV/(dwtt)其中，C 为样品 -萘胺含量(g/ml)；V 为土壤溶液体积(ml)；dwt 为烘干土壤质量(g)；t 为反应时间(h)。V. Acosta-Martnez and M. A. Tabatabai. Arylamidase activity of soils. Soil
5、 Sci. Soc. Am. J. 2000,64:215-221.B. -葡糖苷酶葡糖苷酶(-glucosidase，EC3.2.1.21) 1g 土样土样-试剂试剂：甲苯甲苯；pH 值 6.0MUB 缓冲液；0.5mol/L NaOH；0.5mol/L CaCl2溶液；p-硝基硝基酚酚标准溶液参见磷酸酶测定；pH12.0Tris 缓冲液12.2g 三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷溶于 800ml 去离子水中，- 2 -用 0.5mol/L 的 NaOH 调节 pH 至 12.0，去离子水稀释至 1L；对对-硝基酚硝基酚-D-葡糖苷葡糖苷(PNG)溶液0.377g PNG 溶于 40ml M
6、UB 缓冲液中，用相同的缓冲液稀释至 50ml，在 4下贮存；去离子水MUB 缓冲液(Modified Universal Buffer Solution): 将 12.1 g 三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷（THAM） ，11.6 g 顺丁烯二酸顺丁烯二酸(马来酸马来酸)，14.0 g 柠檬酸柠檬酸和 6.3 g 硼酸硼酸（H3BO3）于 500ml 1 molL-1 NaOH溶液中，再用去离子水稀释至 1L，贮于 4冰箱中。1.改进的 MUB(pH6.0):取 200ml 储备液于配有磁力搅拌器的 500ml 烧杯中，滴入 0.1N的 HCl 搅拌至 pH6.0,水定容至 1L.2.改进
7、的 MUB(pH11):取 200ml 储备液于配有磁力搅拌器的 500ml 烧杯中，滴入0.1NNaOH 的搅拌至 pH11,水定容至 1L.-仪器仪器：分光光度计(400nm)；25ml 三角瓶三角瓶；恒温水浴；摇床；漏斗；滤纸漏斗；滤纸-操作操作：取 1.00g 新鲜土壤(2mm)于 25ml 三角瓶中，加入 0.25ml 甲苯、4.00ml pH 值6.0MUB 溶液和 1.00ml PNG 溶液，盖上瓶塞，充分混匀，于 37培养 1h。然后加入1.00ml 0.5M CaCl2溶液和 4.00ml 0.1M pH 值 12.0 的 Tris 缓冲液中止反应，摇匀，悬液1500g10
8、min，上清液在 400nm 处比色测定。做空白对照时，必需在培养结束之后，加CaCl2溶液和 Tris 缓冲液之后加入底物 PNG 溶液。每个样品必需做一个空白和三次重复。-标准曲线制作标准曲线制作：取 1ml 对对-硝基酚硝基酚标准溶液于 100ml 容量瓶中，用去离子水定容至刻度，再分别取该稀释液 0，1，2，3，4 和 5ml 于 50ml 三角瓶中，用去离子水调节溶液体积至5ml(即为 0、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0g/ml 的对-硝基酚工作液)，然后加入 1.00ml0.5M CaCl2溶液和 4.00ml 0.5M NaOH 溶液，充分混匀后迅速过滤，同上比色测定
9、。-结果结果： -葡糖苷酶活性(g 对-硝基酚g-1h-1) = CV/(dwtt)其中，C 为样品对-硝基酚含量(g/ml)；V 为土壤溶液体积(ml)；dwt 为烘干土壤质量(g)；t 为反应时间(h)。(1.Tabatabai M.A.,1994.Enzymes. In: Weaver, R.W., Augle, S, Bottomly, P.J., Bezdicek, D., Smith, S., Tabatabai, A., Wollum, A. (Eds.), Methods of soil analysis. Part 2. Microbiological and biochem
10、ical properties. No. 5. Soil Science Society of America, Madison, pp.775-833.2.F. Eivazi and M. A.Tabatabai.1988.Glucosidases and Galactosidases in Soils.Soil Biol. Biochem.5.Vol.20,pp.601-606.)C. 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，EC3.1.3.1) 1g 土样土样-试剂试剂：通用缓冲溶液(MUB)贮备液贮备液改进的 MUB(pH11):取 200ml 储备液于配有磁力
11、搅拌器的500ml 烧杯中，滴入 0.1N NaOH 的搅拌至 pH11.0，去离子水定容至 1L.；25mmol/L 对-硝基酚磷酸- 3 -钠溶液(PNP 溶液溶液)0.420g 对对-硝基酚磷酸二钠硝基酚磷酸二钠溶于 40ml pH11.0 MUB 溶液中，用相同的 pH 值缓冲液稀释至 50ml，于 4下保存。；0.5mol/LCaCl2溶液73.5g CaCl2溶于少量去离子水中，并稀释至 1L；0.5mol/L NaOH20g NaOH 溶于 1L 去离子水中；对对-硝基酚硝基酚标准溶液1g 对-硝基酚溶于少量去离子水中，并稀释定容至 1L，于 4下保存。；甲苯甲苯；去离子水去离子
12、水-仪器仪器：分光光度计(400nm)；培养箱；摇床；50ml 三角瓶；50/100ml 容量瓶容量瓶；恒温水浴-操作操作：取 1.00g 新鲜土壤(2mm)于 50ml 三角瓶中，加入 0.25ml 甲苯(泥炭土加 5ml)、4.00ml pH11.0 MUB 缓冲液和 1.00ml 用相同的缓冲液配制的对-硝基酚磷酸钠溶液，盖上瓶塞，充分混匀后，37下培养 1h，然后加入 1.00mlCaCl2溶液和 4.00ml NaOH 溶液，摇匀后迅速过滤，于 400nm 处比色。同时做空白对照，加对-硝基酚磷酸钠溶液之前加入 CaCl2溶液和 NaOH 溶液，并迅速过滤。每个样品三次重复。-标准曲
13、线制作标准曲线制作：取 1ml 对对-硝基酚硝基酚标准溶液于 100ml 容量瓶中， 用去离子水定容至刻度，再分别取该稀释液 0，1，2，3，4 和 5ml 于 50ml 三角瓶中，用去离子水调节溶液体积至 5ml，然后加入 1.00ml0.5M CaCl2溶液和 4.00ml 0.5M NaOH 溶液，充分混匀后迅速过滤，同上比色测定。-结果结果： 土壤磷酸酶活性(g 对-硝基酚/gh) = CV/(dwtt)其中，C 为样品中对-硝基酚含量(g/ml)；V 为土壤溶液体积(ml)；dwt 为烘干土壤质量；t 为反应时间(h)。(1.吴金水,等.土壤微生物生物量测定方法及其应用M.北京:气象
14、出版社,2006,128-129.(2.Tabatabai M.A., 1982. Soil.Enzymes. In: Weaver, A.L., Page, R.H, Miller and D.R., Keeney, D. (Eds.), Methods of soil analysis. Part 2. Microbiological and biochemical properties, Second Edition, No. 9. Soil Science Society of America, Madison, pp.903-943.)D. 芳基硫酸酯酶芳基硫酸酯酶(Arylsulf
15、atase，EC3.1.6.1) 1g 土样土样-试剂试剂：甲苯；醋酸；醋酸钠甲苯；醋酸；醋酸钠称取醋酸钠水合物 68g 溶于 700ml 蒸馏水中，用醋酸调节pH 至 5.8，再用蒸馏水定容至 1000ml 即得；CaCl2；NaOH；0.025M p-硝基酚硫酸酯溶液0.312g p-硝基酚硫酸钾硝基酚硫酸钾溶于少量 pH 值 5.8 的醋酸缓冲液中，并用醋酸缓冲液定容至100ml，存于 4下。-仪器仪器：分光光度计(400nm)；50ml 三角瓶三角瓶；摇床；滤纸；恒温水浴；漏斗-操作操作：取 1.00g 鲜土(2mm)于 50ml 三角瓶中，加入 0.25ml 甲苯、4.00ml 0.
16、5M pH 值 5.8醋酸缓冲液和 1.00ml 0.005M 对-硝基酚硫酸酯溶液，混匀，盖上瓶塞，在 37下培养 1h，再加入 1.00ml 0.5mol/L CaCl2溶液和 4.00ml 0.5mol/L NaOH 溶液，混匀，慢性滤纸过滤，- 4 -400nm 处比色，空白对照应在加入 CaCl2和 NaOH 溶液之后加底物，并迅速过滤。-标准曲线制作标准曲线制作：取 1ml 对对-硝基酚硝基酚标准溶液于 100ml 容量瓶中， 用去离子水定容至刻度，再分别取该稀释液 0，1，2，3，4 和 5ml 于 50ml 三角瓶中，用去离子水调节溶液体积至 5ml，然后加入 1.00ml0.5M CaCl2溶液和 4.00ml 0.5M NaOH 溶液，充分混匀后迅速过滤，同上比色测定。-结果结果： 芳基硫酸酯酶活性(g 对-硝基酚(gh)-1 = CV
