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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Hela 细胞的放射增敏作用细胞的放射增敏作用作者：汤继英 1,2， 潘东风 1， 石小燕 1， 王贤和 1， 陈 萍1* 作者单位：(1 郧阳医学院附属人民医院肿瘤科，湖北 十堰 442000;2 湖北中医学院，湖北 武汉 430061)【摘要】 目的：探讨三氧化二砷(As2O3)对人宫颈癌 Hela细胞的放射增敏作用及其机制。方法：MTT 法确定 As2O3 对 Hela细胞的半数致死浓度(ID50);克隆形成法观察 20%ID50 的 As2O3 对Hela 细胞的放射增敏作用;流式细胞仪测定细胞周期。结果：细胞生长抑制率随 As2O3 浓度增加
2、而增高; As2O3+照射组的细胞存活率、D0 值和 Dq 值均小于单纯照射组(P0.05);存活曲线肩区(Dq)变小，放射增敏比(SER)为 1.39;As2O3 和 -射线均能使细胞阻滞在 G2/M期，联合应用比单独应用抑制作用显著(P0.01)。结论：As2O3 对宫颈癌 Hela 细胞株有明显的放射增敏作用;可能与 As2O3 改变细胞周期有关。【关键词】 三氧化二砷;宫颈癌;Hela 细胞;放射增敏剂Irradiation Enhancement of Arsenic Trioxide on Human Cell Line of Cervical Cancer TANG Ji-yin
3、g1,2,PAN Dong-feng1,SHI Xiao-yan1,WANG Xian-he1,CHEN Ping1* (1Department of Oncology,Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000;2Hubei College of Traditional Chinese Medicine,Wuhan,Hubei 430061,China)KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Objective To investigate the irradiation enhancement effect of
4、 arsenic trioxide on human cervical carcinoma Hela cells and its possible mechanism.Methods MTT assay was used to measure the survival rate of the cervical carcinoma Hela cells.Then the half inhibitory dosage (ID50)was calculated.Colony forming assay was carried out to take count of survival fractio
5、n.Cell survival curve was analyzed with Multi-target single-hit model and then sensitive enhancement ratio(SER) was calculated.Flow cytometry was performed to assess the influence of arsenic trioxide on cell cycle distribution. Results (1)Inhibitory effect of arsenic trioxide on cell proliferation w
6、as in a dose-dependent manner.(2)Cell survival rate was lower after treatment with the combination of arsenic trioxide and radiation than that of radiation alone,Dq and D0 value were decreased after treatment with the combination of arsenic trioxide and radiation than that of radiation alone(Dq :1.0
7、3 Gy vs 1.89 Gy, D0 :2.49 Gy vs 3.45 Gy),with SER being 1.39.(3)Both Gy 60Co - and 2mol/L arsenic trioxide could arrest Hela cell to G2/M as assayed by flow cytometry.The inhibitory effect was much more obvious when arsenic trioxide and irradiation were combined than either of them was used alone. C
8、onclusion Arsenic trioxide is able to enhance radiation effect obviously on human cervical squamous carcinoma Hela cells,which may be due to its regulation on cell cycle.Key words:Arsenic trioxide;Cervical carcinoma;Hela KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 期以上多采用放疗。目前临床上提高肿瘤的放射敏感性主要利用化疗药物如顺铂、泰素等，但是由于化疗药物对正常细胞的毒性作用
9、较大，且与放疗的副反应有协同作用，病人一般难以耐受。近年来研究发现许多中草药具有抗肿瘤、放疗增效等作用, 三氧化二砷(As2O3)就是其中的一种。As2O3 是中药砒霜的主要成分，对卵巢癌、恶性胶质瘤、淋巴瘤等1-3肿瘤的放疗具有增敏效应，但其在宫颈癌方面的研究则较少。本研究拟观察 As2O3 对 Hela 细胞的放射增敏作用,并探讨其可能的作用机制。1 材料与方法1.1 材料人宫颈癌 Hela 细胞(武汉大学中南医院肿瘤研究所);亚砷酸氯化钠注射液(哈尔滨伊达药业有限公司，用生理盐水配制成 1 mmol/L 的储存液，4 冰箱备用，使用前用培养液稀释至所需浓度);GWXJ80 型 60Co
10、远距离治疗机;流式细胞仪(美国 Beckman Coluter公司)。1.2 细胞培养及照射条件宫颈癌 Hela 细胞培养于含 10%新生牛血清 RPMI-1640 培养基中，并置于含 5%CO2 的 37 温箱中培养。60Co 远距离治疗机室温下照射，-射线的剂量率 40 cGy/min。1.3 Hela 细胞对 As2O3 药物敏感性测定KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 0.5、1、5、10、25、50 、75 、100 mol/L 8 个浓度，每个浓度设 5 个复孔，取对数生长期细胞，经 0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，接种于 96 孔培养板培养过夜(每孔 1l04 个细
11、胞，含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养液200 L)，次日换液,加 As2O3 使其终浓度如上。培养 48 小时后每孔加入 MTT(5 g/L) 20 l，继续孵育 4 h，吸去培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 200 L，振动 10 min 后酶标仪检测波长为 572 nm 的吸光度值，计算细胞抑制率。抑制率=1-(实验组吸光度值/对照组吸光度值)100%，绘图后求半数致死剂量(ID50)值。1.4 克隆形成法观察放射增敏作用按放疗剂量 0、1、2、4、6、8 Gy 分为 6 个组，于 25 cm2培养瓶中分别接种不同数量的细胞，每组设 3 个平行样本，每个剂量组分别设单纯
12、照射(单放组)和照射+2 mol/L As2O3(药放组)，待细胞贴壁后药放组加入 As2O3，使其终浓度为 20%ID50，24 h 后接受照射，照射后 24 h 弃掉含药物的培养液，换含 10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液，继续培养 1113 d 后固定、染色，计数含 50个细胞以上的克隆数。存活分数的计算方法为：处理组克隆形成率/对照组克隆形成率，采用“多靶单击模型4“拟合细胞存活曲线，计算放射增敏比(SER)。“多靶单击模型“方程：SF=1-(1-e-D/D0)N, Dq=D0N，其中SF 为细胞存活率，D 为放射剂量(Gy)，D0 代表平均致死量，Dq 代表准域剂量，N 为外
13、推数。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 细胞周期分析将细胞接种于培养瓶中，分为空白组、As2O3 组(单药组)、单纯照射(单放组)、照射+2 mol/L As2O3(药放组)，每个组设 3 个平行样本，待细胞贴壁后药物干预组加药， 终浓度为 2 mol/L As2O3，24 h 后单放及药放组接受 2 Gy 放疗，收集处理后的1.0106 个细胞用 PBS 清洗 2 次(1 500 r/min，5 min)，加入 70%冷乙醇 4 固定过夜，清洗去除固定液，加入 PBS 100 L 混匀细胞，再加入 10 g/L RNAase 2 L，充分混匀，置 37 水浴锅中加温 30 min，加
14、碘化丙啶(PI)染色液 (20 g/mL)，常温避光 30 min 后，流式细胞仪检测，Multicycle 软件分析，结果以细胞周期各时相细胞百分率表示。1.6 统计学方法所得数据以均数标准差(xs)的形式表示，Execl 软件模拟细胞生长抑制曲线，SPSS 13.0 软件模拟生存曲线并进行方差分析，以 P0.05 为差别有显著性，以 P0.01 为差别有极显著性差异。2 结果2.1 Hela 细胞对 As2O3 药物敏感性细胞生长抑制率随 As2O3 浓度的增加而增大，绘图后求半数致死剂量(ID50)值 10.86 mol/L(见图 1)。图 1 三氧化二砷对 Hela 细胞的生长抑制2.
15、2 As2O3 对 Hela 细胞的放射增敏作用放射剂量-细胞存活曲线见图 2，多靶单击模型主要参数见KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 1。结果显示 As2O3 对宫颈癌 Hela 细胞有放射增敏作用，经药物处理后平均致死剂量(D0)降低，存活曲线肩区(Dq)变小。表 1 照射后 Hela 细胞存活曲线主要参数2.3 细胞周期分析流式细胞仪检测细胞周期结果表明，放射及药物均能提高G2/M 期的细胞比例，二者联合能显著提高效果(P0.01)(见表 2)。表2 As2O3 与放疗对 Hela 细胞周期的影响(%)3 讨论As2O3 是中药砒霜的主要成分，其临床适应症不仅仅局限于白血病的治疗，对实体瘤的临床应用研究也日趋增多。有关As2O3 对细胞杀伤机制的研究大多与 As2O3 具有放射增敏效应有关1-3，但 As2O3 对宫颈癌放射增敏的研究报道甚少5。本研究利用 MTT 法确定 As2O3 对宫颈癌细胞系 Hela 的细胞毒作用,证实细胞生长抑制随 As2O3 浓度的增加而增强，48 h 半数致死剂量(ID50)值10.86 umol/L,说明 As2O3 与放射治疗联合对宫颈癌具有增敏作用。“多靶单击模型“拟合经典的细胞存活曲线,其参数 D0 值为平均致死剂量,是一次照射能杀灭 63%的细胞或 37%细胞存活的剂
