色谱分析方法的建立

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1、1色谱分析方法的建立色谱分析方法的建立第一部分 色谱法系统的选择与应用 第二部分 气相色谱法的建立 第三部分 液相色谱法的建立第一部分 色谱法系统的选择与应用 第一章 气相色谱法的特点 第二章 高效液相色谱法的特点 第三章 气相色谱和液相色谱的比较 第四章 分析条件的确定 第五章 样品的制备 第六章 定量 第七章 仪器选购的原则第二部分 气相色谱法的建立 第一章 前言 第二章 色谱分离条件选择的指标 第三章 初始操作条件的确定 第四章 填充柱的选择要点 第五章 毛细管柱的选择 第六章 检测器操作条件的选择 第七章 程序升温操作条件的选择第三部分 液相色谱法的建立 第一章 结论 第二章 分离的基

2、础 第三章 检测灵敏度与选择性 第四章 色谱柱 第五章 反相 HPLC 第六章 梯度洗脱 第七章 常规样品反相分离的系统方法第一部分 色谱法系统的选择与应用 第一章 气相色谱法的特点 1，色谱柱内现象单纯，可以从理论上理解。 2，若用非极性柱，组分按沸点顺序流出。因此，在分配气相色谱法中，若已知化合物，则 可预测流出顺序。 3，能较容易地制备具有高分离能力的色谱柱，并可在较长时间内保持稳定的性能。 4，因为移动相是气体，其粘度小，所以增加色谱柱长度可改善分离能力。 5，样品组分在固定相和移动相中易扩散，能迅速达到分配平衡，故可提高移动相的流速以 缩短分析时间。 6，检测惰性气体中的样品组分时，

3、可以使用各种高灵敏检测器，所以能做极微量分析和特2定组分的高灵敏度的选择性检测。 7，使用通用型检测器时，可以预测注入样品在多大程度上能作为色谱峰流出并被检测，所 以分析的可信度高。在不要求精度时，也可以把峰面积百分数近似作为组成百分数，进行 快速定量分析。 8，容易与质谱仪或付里叶变换红外光谱仪联用，便于多组分混合物的分离和鉴定。 9，适于分析的物质仅限于在某种形式下为热稳定的挥发性物质。所以从全部化合物来看， 适用范围较窄，约为 20%。 10，用选择性检测器做微量分析时，样品必须经过前处理以除去干扰组分。第二章 高效液相色谱法的特点 1，适用样品范围广，80%的分析对象可借此法分析。 2

4、，为进行分离，可以根据样品的组分将流动相和固定相的组合最佳化。如果熟悉液相色谱， 这是非常有利的，但对初学者来说，这是困难的。 3，可以使用高效的分离柱，易于分离复杂的多组分混合物。 4，把被分离的组分溶解在流动相中，可以全部回收之。 5，可以使用多种非破坏性高灵敏度和选择性的检测器，把几种检测器串联起来，根据其对 应特性，获取与定性有关的重要信息。 6，只能检测从色谱柱流出的组分。 7，由于没有通用型高灵敏度检测器，所以在分析未知混合物而没有色谱峰的时候，无法确 定其原因是分离条件不合适，还是检测器没有响应。 8，采用尺寸排斥色谱法时，从低分子到高分子的样品全部流出，而且流出顺序是从高分子

5、量开始，故可根据保留容量推测分子量，最适于做未知样品的组成分析。 9，测定精度好。因为注入精度比气相色谱好，故可以用绝对工作曲线。 10，虽然示差折光检测器为通用型检测器，但和气相色谱的热导检测器和氢火焰检测器相 比，由于化合物之间的响应不同，所以用峰面积百分数求由多种化合物组成的混合物时问 题较多。 11，要限制色谱柱的使用条件（温度、压力、流动相等） 。而且与气相色谱相比，性能随时 间的变化较大。必须定期用标准品在标准条件下检查色谱柱的性能。若按照不同的样品对 象，固定使用色谱柱，对色谱柱的寿命是有利的。 12，制作色谱柱需要特殊装置和专门技能。 13，柱外死体积对色谱柱的性能有重大的综合

6、性影响，而且连接方法依仪器制造厂而异。 14，与气相色谱法相比，由于共存物质对分离的影响小，易于制备分析样品。第三章 气相色谱和液相色谱的比较 1，流动相 2，固定相 3，分析对象 4，检测技术 5，制备分离1，流动相 GC 中用气体作流动相，又叫载气。常用的载气有氦气、氮气和氢气。与 HPLC 相比， GC 流动相的种类少，可选择范围小，载气的主要作用是将样品带入 GC 系统进行分离，其 本身对分离结果的影响很有限。而在 HPLC 中流动相种类多，且对分离结果的贡献很大。3换一个角度看，GC 的操作参数优化相对 HPLC 要简单一些。此外，GC 载气的成本要低于 HPLC 流动相的成本。 2

7、，固定相 因为 GC 的载气种类相对少，故其分离选择性主要通过不同的固定相来改变，尤其在 填充柱 GC 中，固定相常由载体和涂敷在其表面的固定液组成，这对分离有决定性的影响， 所以，导致了种类繁多的 GC 固定相的开发研究。迄今已有数百种 GC 固定相可供我们选 择使用，但常用的 HPLC 固定相也就十几种。故 HPLC 在很大程度上要靠选用不同的流动 相来改变分离选择性。不然，毛细管 GC 常用的固定相也不过十几种。在实际分析中，GC 一般是选定一种载气，然后通过改变色谱柱（即固定相）以及操作参数（柱温和载气流速 等）来优化分离，而 HPLC 则往往是选定色谱柱后，通过改变流动相的种类和组成

8、以及操 作参数（柱温和流动相流速等）来优化分离。 3，分析对象 GC 所能直接分离的样品应是可挥发、且是热稳定的，沸点一般不超过 500。据有关 资料统计，在目前已知的化合物中，有 20%到 25%可用 GC 直接分析，其余原则上均可用 HPLC 分析。也就是说 GC 的分析对象远没有 HPLC 多。 4，检测技术 GC 常用的检测技术有多种，比如热导检测器（TCD） 、氢火焰离子化检测器（FID） 、 电子俘获检测器（ECD） 、氮磷检测器（NPD） ，又叫热离子检测器（TID）等。其中 FID 对大部分有机化合物均有响应，且灵敏度相当高，最小检测限可达纳克（ng）级。而在 HPLC 中尚无

9、通用性这么好的高灵敏度检测器。商品 HPLC 仪器常配的也就是紫外-可见光 吸收检测器（UV-Vis）和示差检测器（RI） 。前者的通用性远不及 GC 中的 FID，后者的灵 敏度又较低，且不适于梯度洗脱。当然，不论 GC 还是 HPLC，都有一些高灵敏度的选择 性检测器，GC 有 ECD 和 NPD 等，HPLC 则有荧光和电化学检测器。较为理想的检测器应 该首推 MS，但在这一点上，GC 目前要优于 LC。因为 GC 流动相的特点，它与 MS 的在 线联用已不存在任何问题，特别是毛细管 GC 与 MS 的联用（GC/MS）已成为常规分析方 法。而 HPLC 与 MS 的联用就受到了流动相的

10、限制。虽然目前已有多种接口，如离子束、 热喷雾和电喷雾等，但流动相的选择还是受到明显的限制。 5，制备分离 在新产品研究开发过程中，或在未知物的定性鉴定工作中，常需要收集色谱分离后的 组分作进一步的分析，而某些高纯度的生化试剂则是直接用色谱分离来制备的。就这一点 而言，GC 在原理上应该是有优势的，因为收集镏分后载气很容易除去。然而，由于 GC 的 柱容量远不及 HPLC，如果用 GC 作制备，那是相当费时的。因此，制备 GC 的实用价值 很有限。制备 HPLC 则有很广泛的应用。第四章 分析条件的确定 1，样品信息 2，流动相 3，固定相 4，检测器1，样品信息 分析实际样品时，必须尽量收集

11、与样品有关的资料。 （1）分析的目的是什么；（2）分 析对象物质及其母体结构是什么；（3）分析对象中有多少种成分；（4）分析对象中各种 成分的预想含量-主组分或微量组分；（5）分析对象物质及其母体结构的物理化学性质；4（6）样品量，样品的形态；（7）检测限，测定限，灵敏度，分析时间；（8）有无分析实 例和标准样品。 气相色谱的分析条件比高效液相色谱容易确定。一般而言，用吸附剂作填料，用热导检 测器分析含有无机气体的样品。分析有机化合物时，应注意其最高使用温度，选用分配型 液相填料，若用氢火焰离子化检测器，分析的成功率在 90%以上。在高效液相色谱中，必 须针对样品选择流动相和固定相的最佳组合。

12、由于对过去的分析实例还没有归纳得像气相 色谱那样完整，所以初学者难以确定分析条件。 2，流动相 在气相色谱中，流动相只影响分析时间和柱效率。若用理论塔板高度对移动相的线速 度作图，则存在极小点，表明在某一确定流速下，色谱柱的效能最高。He 和 H2的最佳流 速大于 N2的最佳流速。因此，柱效相同时，要获得高流速最好用 H2，从安全性考虑用 He，从经济上考虑用 N2。 在液相色谱中，流动相与固定相的组合取决于样品成分的保留能力。若组合不当，样 品或者直接通过色谱柱，或者完全被保留而不洗脱。在液相色谱中，流动相的流速缓慢时 柱效能好，但影响分析时间。应尽量采用高纯度的流动相。流动相中的不纯物与假

13、峰、固 定相寿命和检测器有关。选择液相色谱流动相时必须考虑粘度。在洗脱能力相同时，应选 用粘度小的流动相。 3，固定相 在气相色谱中，一般是从制造厂家购买色谱柱填料后自己装柱。但对毛细管柱一般是 购买内壁已涂覆好的成品。在液相色谱中，一般是直接购买填充柱。 对气相色谱填料，必须指明下列内容：（1）载体的种类；（2）载体的前处理方法； （3）载体的粒度范围；（4）有无减尾剂及附着量；（5）液相的种类；（6）液相量。 4，检测器 与流动相的状态相对应，气相色谱以离子化检测器为主，有氢火焰离子化检测器，热 导检测器，电子俘获检测器，火焰光度检测器，氮磷检测器，质谱检测器等；而高效液相 色谱则用光学和

14、电化学的检测器，有紫外检测器，示差折光检测器，荧光检测器，电导检 测器，电化学检测器，质谱检测器等。第五章 样品的制备 1，引言 2，样品类型 3，液体样品的预处理 4，固体样品的预处理 5，柱切换 6，衍生化1，引言 样品制备的目的是为了使试样中的干扰物质相对除净、不损害色谱柱，且能与将使用的 色谱方法相兼容；即样品溶剂能快速汽化或溶于流动相而不影响样品的保留值与分离度。 样品预处理的选择 （1）样品的收集：要有代表性 （2）样品的贮藏与保存：用适宜的惰性、密封容器 （3）样品的初加工：如干燥、过筛、碾细等 （4）称重或定容稀释：有必要注意活性、不稳定组分5（5）其它的样品加工方法：溶剂替换

15、、除盐、蒸发、冷冻干燥等 （6）除去微粒杂质：过滤、固相萃取、离心 （7）样品的提取：液体样品的提取；固体样品的提取 （8）衍生化：主要用于提高被测物的检测灵敏度，有时也用于改善分离 2，样品类型 样品基质可分为有机基质和无机基质，也可进一步再分为固体、半固体（包括乳膏剂、 胶剂、混悬剂、胶体剂） 、液体和气体。 与气体或固体相比，制备进行色谱分析的液体样品要容易得多。许多色谱分析就是基 于“稀释即进样”的步骤；有的固体样品易于溶解，随后即可进样或进一步处理；而另一 些固体基质在常规溶剂中不溶，则必须将被测物从固体基质中提取出来。 固体样品的传统萃取方法：（1）固-液萃取；（2）索氏提取；（3

16、）强制流动浸出； （4）均匀化；（5）超声波处理；（6）溶解。 固体样品的现代萃取方法：（1）加速溶剂萃取；（2）自动索氏提取；（3）超临界流 体提取；（4）微波辅助提取；（5）热提取。 3，液体样品的预处理 3.1 液-液萃取 用液-液萃取（LLE）可从干扰物中分离出被测物，通过被测物在两种不混溶的液体中 的分配系数不同达到分离的目的。LLE 中一相通常为水相，而另一相为有机溶剂。亲水性 强的化合物进入极性的水相多，而疏水化合物将主要溶于有机溶剂中。萃取进入有机相的 被测物经溶剂挥发容易回收，而提取进入水相中的被测物经常能够直接注入反相 HPLC 色 谱柱中进行分析。 由于萃取为一平衡过程，效率有限，两相中仍存在数量可观的被测物。因此可利用包括 改变 pH、离子对、络合作用等的化学平衡，以提高被测物的回收率和/或消除干扰。 许多 LLE 操作在分液漏斗中进行，每一相的体积一般都需几十或几百毫升。当定量回 收率大于 99%时，需要两步或多步萃取。 与 LLE 有关的实际问题包括： （1）发生乳化；（2）被测物牢固地吸