《人自身抗原Jo1的基因克隆和原核表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人自身抗原Jo1的基因克隆和原核表达（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、2 5 4 人自身抗原J o 一1 的基因克隆和原核表达杨湘越兰小鹏廖剑钟智强朱忠勇J o - 1 抗原是组氨酰一t R N A 合成酶( H A R s ) 基因的表达产 物，与多发性肌炎皮肌炎( P M 皿M ) 的发病机理有关。应用R T P C R 技术，我们在国内首次克隆表达成功人自身抗原J 口l ，为下一步建立以多种基因重组自身抗原为配体的自身抗体金标快速检测方法奠定了基础。1 材料与方法1 1质粒、菌株和细胞株：p M D l 8 一TV e c t o r 购自T a K a R a 公司；p G E X 一5 T ，大肠杆菌J M l 0 9 ，B L - 2 1 ，本室保存
2、； 人白血病淋巴细胞H L - 6 0 由福建省血液病研究所黄惠娟博士惠赠。1 2 主要试剂和仪器：各种限制性内切酶，T 4D N A 连接酶，T a q 酶，P C R 扩增试剂盒，D 1 2 0 0 0D N A 标志物，均购自 T a K a R a 生物技术有限公司。引物由上海生工合成。3 ST r i d 总R N A 抽提试剂盒，反转录系统，质粒抽提和胶回收试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司，标准蛋白分子量标志物，核糖核酸酶R N a s eA ，氨苄青霉素，硝酸纤维素膜购自上海华舜生物工程有限公司。H R P 标记鼠抗人抗体( 华美生 物技术公司) 。抗一标准血清购自S i
3、g m a 公司。P C R 扩增仪：P E2 4 0 0 型( A B I ) ，S X 3 0 0I i r k q g eS y s t e m 四星凝胶成像系统：上海四星生物技术有限公司，超声仪、紫外分光光度计、蛋白半干电转移装置：P h a r m a c i a 。二氧化碳孵箱：美国产。1 3 细胞培养：人白血病淋巴细胞H L ，6 0 在二氧化碳孵箱培养，收获( 细胞数最大不超过1 1 0 。7 ) ，离心，弃上清。1 4总R N A 提取及重组鼠白血病毒逆转录酶( M - M u L VR T ) 第一链c D N A 合成：按操作说明进行。1 5P C R 扩增目的基因：我们
4、在G e n e b a n k 库检索到b1 基因的编码序列，分别在其两侧自行设计引物，并引入限制性酶切位点，以利克隆之需。引物1 为：5 - a a gg g at c ca t gg e ag a ge g t g e g g c gc t g g a g - 3 ，引物2 为：5 一a a g g t c g a c t c a g c a g a tg c ag a gg g gc t gg e e 一3 ( 注：g g at e e 为B a m HI 限制性酶切位点，g t cg a c 为S a lI 限制性酶切位点) 。P C R 循环条件为：9 4 预变性3 分钟，9 4
5、4 5 秒6 5 4 5 秒7 2 1 分钟，循环3 0 次，7 2 延伸3 0 分钟。取1 0 u l1 2 琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。1 6P C R 产物的回收、纯化、T A 克隆及测序：转化子采用蓝白斑筛选，重组克隆在x - g a l I P T G 平板上呈白色，非重 组克隆呈蓝色。挑取白色菌落至含氨苄青霉素的L B 液体培养基，3 7 培养过夜。交上海生工公司用M 1 3 通用引物直接进行测序来确定是否含有目的克隆。基金项目：福建省青年人才科技创新基金资助项目( 2 0 0 2 J 0 6 0 )作者单位：3 5 0 0 2 5 福州，南京军区福州总医院全军医学检验中心1
6、 7 定向克隆：分别将上述鉴定好的T A 克隆和含p G Z X 一5 TG S q “ 融合表达载体的大肠杆菌增菌后抽提质粒，用合适的双酶切后，电泳回收所需片段，定向连接，重组质粒经 C a C l 2 法转导入宿主菌E c o l iB 1 2 2 1 ，挑取转化子，酶切鉴定。1 8 重组质粒在大肠杆菌的表达：将阳性转化子加入L B 培养液，3 7 振荡培养4 5 m i n 后，均匀涂布予L B 平板上( 含氨苄青霉素1 0 0 p g m 1 ) ，3 7 培养过夜，同时用E c o E B 1 2 1 空菌和p G E X - 5 T 转染菌分别作阴、阳性对照。从上述在L B A m
7、 p 平板过夜培养生长的细菌克隆中挑选1 个生长良好，直径约为2 m m 的菌落，接种于L B A m p 培养液3 7 振摇过夜，次日1 ：1 0 0 0 稀释转种于新的1 L L B A m p 培养液中， 3 7 振摇培养约3 h ( A 值约为0 5 0 6 ) ，然后加入I P T G 至终浓度为l m m o l L ，诱导3 h 。收集少量菌液，煮沸裂菌后离心取上清。1 9S D S - P A G E ：取上述I P T G 诱导菌上清2 0 u l 与2 ( 上样缓冲液等体积混合后上样，同时取1 0 u l 对照上样，行S D S - P A G E 电泳，考马斯亮兰R 2
8、5 0 染色。1 1 0W e s t e r nb l o t 利用半干电转移仪将S D S - P 6 娅凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5 脱脂奶粉为封闭试剂，一抗为自身抗原的标准血清，二抗为鼠抗人的辣根过氧化物酶复合物，在D A B 、H z 0 2 下显色。2 结果2 1J o - 1 基因的扩增：R T _ P C R 结果电泳分析显示一条约1 5 k b 扩增条带，其大小与预计1 5 2 6 b p 相符。2 2T A 阳性克隆测序图谱：双向测序图谱与G e n e b a n k报道的完全一致。2 3p G E X 一5 T - J o - 1 重组阳性克隆质粒的酶切分析：经
9、 B a m HI 和S a lI 酶切后，得到约5 0 0 0 b p 和1 5 2 6 b p 两条片段，与预期结果一致。 2 4 融合蛋白的S D S - P A G E 和W e s t e r nb l o t 分析：结果 显示一条8 0 K D 的特异性蛋白条带。3 讨论自身免疫病是一大类以产生各种各样的自身抗体为特征的全身或局部性疾病，其较高的发病率和严重的危害程度越来越受到医学界的关注，由于不同的自身免疫病具有不同的自身抗体谱，因此自身抗体的检测对于自身免疫病的研究、诊断和治疗具有重要的意义。 目前临床检测P M D M 的方法主要是蛋白免疫印迹法( 母T ) ，由于I B T
10、 法所采用的未经纯化的兔胸腺抗原中有不同的蛋白质，虽然这些蛋白质分子量不同，但由于其带电荷不同，在电场中泳动速度仍可相同，从而使不同分子量的蛋白质出现电泳距离一致的条带。因此分子量相同的条带并不一定显示为抗某种单一蛋白的抗体。另一方面，I B T 法中的抗原是经过变性的，即使有些抗体可能识别转移膜上的变性抗原决定簇，但并非所有抗体均能与变性抗原决定簇反应，在实际操作中经常出现这样或那样的问题。例如：标准带不显色、区带不显色或不清晰、非特异性的区带太多致结果不好报等等， 这样易造成临床的误诊和漏诊。研究表明，在多发性肌炎( P M ) 的致病机理中，J w l 可能 特异性地介入天然和获得性免疫
11、反应，促进抗原提呈细胞( A P C s ) 和T 细胞的增殖，导致免疫耐受性的解除，引发以 C D 4 + T 细胞介导为主的自身免疫性肌细胞炎症。抗J o - 1 是 多发性肌炎皮肌炎( P M 佃M ) 的特异性标志性抗体，在P M 2 5 5 D M 中的检出率很高( 7 8 5 ) ，与抗U 1 R N P7 0 K D ，抗S S - A 和抗S S - B 相比，它的特异性最好。由p G E X - 5 T 构建的G S T和目的基因的融合体，有利于蛋白质的稳定表达和纯化，而采 用高纯度的基因重组自身抗原可望减少上述情况的发生，为临床提供更为敏感、特异、快速且可同时检测多种自身抗
12、体的新方法。I 型胶原吡啶交联终肽在类风湿关节炎患者血清中测定的临床意义乐爱平赵旭兰张经宇类风湿关节炎是以慢性、进行性、对称性关节炎为主要临床表现的多系统性炎症性的自身免疫性疾病。常以缓慢而隐 匿方式起病，6 0 N 7 0 的患者在活动期血清中出现R F ，但R F的特异性较差，C R P 的敏感性不够高，因而给疾病的早期诊断及病情监测带来一定的困难，为此我们采用E L I S A 定量测定对R A 患者血清中工型胶原吡啶交联终肽的浓度变化进行探讨。1 材料和方法1 1 标本来源：8 0 例的类风湿关节炎患者血清均来自我院2 0 0 4 年1 0 月至2 0 0 5 年1 月门诊及住院病人，
13、其中男性3 1 例、女性4 9 例，年龄在1 8 7 0 岁、平均年龄4 6 3 岁，其诊 断均符合1 9 8 7 年美国风湿病学会( 舰q 拟订的诊断标准，按 S t o k e 指数将R A 组患者分为R A 活动期患者5 5 例，缓解稳定期患者2 5 例。正常对照组均来自健康无偿献血者的血清，其中男性1 9 例、女性3 3 例，年龄与R A 组结构相配，均无肝、肾功能损害、自身免疫性疾病、传染病、感染及肿瘤。1 2 方法：IC r P 浓度采用E u S 八( 竞争法) 定量测定，其结果判定通过定值标准品0 、1 0 、2 5 、5 0 、1 0 0 、2 5 0 、5 0 0 的同时测
14、定，采用C u b i cS p l i n ed a t ar m d d 由E T I m a x 3 0 0 0全自动酶免分析仪自动判读，单位为g g d ；R F 、C R P 采用免疫散射比浊法测定，单位分别为I U m l 、m g d l ；所有操作均严格遵守实验室s 0 P 文件。1 3 仪器：D i a s o f i n 公司的E T I m a x 3 0 0 0 全自酶免分析仪；美国B a c k m a n 公司的A r r a y3 6 0s y s t e ，n 。 1 4 试剂：IC r P 浓度定量测定试剂由芬兰O r i o nD i a g n o s t
15、 i a 公司提供，批号为9 5 9 5 0 1 ，有效期为2 0 0 5 0 2 1 8 ，其线 性范围为1 - - 5 0 p g 1 ；R T 和C R P 测定试剂由美国B a c k m a n 公 司提供，批号为M 4 0 7 3 8 4 和M 4 0 5 0 6 0 ，有效期为2 0 0 6 0 6 3 0 和2 0 0 6 0 5 3 1 ；试剂均在有效期内使用。1 5 统计学处理：I c r P 浓度以X s ( “g 1 ) 表示，多组均数比较采用方差分析，两指标间相关分析采用线性相关分析，率的显著性检验采用配对四格表资料的z 2 检验，均由S F s s l 0 O 软件
16、包自动处理。2 结果2 1R A 组与正常对照组血清IC T P 、R F 、C R P 浓度检测结果见表1作者单位：3 3 0 0 0 6 ，江西医学院第一附属医院检验科R A 活动期组分别与R A 缓解稳定期组和正常对照组的 血清IC T P 浓度的均值问均存在差异显著性( P 0 0 5 ) 。 表1R A 组与正常对照组血清Ia r P 、R F 、C R P 浓度的比较2 2R A 组血清中各检测指标间的相关性见表2由表2 可知，在8 0 例R A 患者血清中Ic r P 的浓度与R F 、C R P 均呈正相关，其相关系数分别为0 3 8 8 、0 6 4 7 ( p 0 0 0 1 ) ；C R P 与R F 亦呈正相关，其相关系数为0 2 7 5 ( P 0 0 5 ) 。表2R A 组中各检测指标问的相关分析结果2 3R A 活动组患者血清C R P 与IC T
