《猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒混合感染的诊断与防制分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒混合感染的诊断与防制分析（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 猪繁殖与呼吸综合征、圆环病毒猪繁殖与呼吸综合征、圆环病毒 2 型和猪瘟病毒的型和猪瘟病毒的混合感染的诊断与防制分析混合感染的诊断与防制分析夏伟1、2 李鹏1 危艳武3 张宇辉2 罗玉均2 冯春复21、黑龙江八一农垦大学 黑龙江 大庆 163319 2、哈尔滨维科生物技术开发公司 黑龙江 哈尔滨 150001 3、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪传染病研究室 哈尔 滨 150001摘要摘要:2011 年 12 月，南方某大型猪场爆发以母猪流产，死胎，弱仔，哺乳期仔猪发生体温 升高，皮肤发绀，呼吸衰竭，顽固性腹泻；保育仔猪发烧，聚堆，皮肤红，昏睡，腹股沟 淋巴结肿大为主要症状的疾病，死淘率高。
2、剖杀 3 头发病哺乳仔猪，3 头死亡保育猪取淋 巴结、脾、肺脏病变组织用 PCR，RT-PCR 方法分别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，圆环 病毒 2 型，猪瘟野毒为阳性，结合本病的临床症状和病理剖检确诊为猪繁殖与呼吸综合征， 圆环病毒 2 型，猪瘟的混合感染。 关键词关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒；圆环病毒 2 型；猪瘟病毒；混合感染；诊断猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是世界范围内一种重要的猪传染病,1996 年哈尔滨兽医研 究所郭宝清首次证实我国有 PRRS 存在1，并从繁殖障碍猪群分离到 PRRSV2。近几年 对我国发病猪群的血清检测结果表明，该病现已存在于我国大部分地区3，并且呈暴发式 流
3、行，给养猪业造成了极大的经济损失。特别自 2006 年“猪高热病”流行后，据有关研究表 明，猪繁殖与呼吸综合征变异毒株是由普通猪繁殖与呼吸综合征病毒的 NSP2 段基因发生 了缺失变异而来，其临床症状主要是出现“三高一低”即高热（40 以上） 、高发病率、 高死亡率、低治愈率；猪群出现皮肤发红，个别有神经症状，能导致母猪流产甚至死亡， 给养猪业的发展带来重创。猪圆环病毒 2 型（PCV2)感染已经是威胁当前世界养猪业的一 个重要疾病，1991 年 PMWS 首次在加拿大被发现，目前已证实呈世界性流行。PCV2 感 染引起的相关疾病在我国的流行情况也十分严重， 给养猪业造成巨大的经济损失4,5。
4、我 国学者在我国许多地方都分离出了这种病毒,且和其他病毒混合感染的情况日益明显，PCV- 2 感染病例在临床上经常可见。猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高致死性、烈性 传染病。近几年随着我国规模化养猪业的发展,猪瘟的发生出现一些新特点,表现为发病年龄 小、散发流行、混合感染以及非典型性或隐性等特点6，这又给本病的防治带来了很大的 困难。生产实践中，PRRSV、PCV-2 混合感染7，PRRSV、CSFV 混合感染8， CSFV、PCV2 混合感染9最为常见。本试验应用 PCR，RT-CR 方法结合临床症状和病理 剖检对上海某猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV） ，圆环病毒型
5、（PCV2)，猪瘟病 毒（CSFV）混合感染进行了确诊,从而为猪场防制本病，制定合理的免疫程序提供科学依 据。1 材料与方法材料与方法 1.1 病料来源 来自上海某猪场的 6 份发病猪和死亡猪的肺脏、脾脏、淋巴结等脏器，编 号，3、4、5 号为哺乳仔猪，6、7、8 号为保育仔猪。冷冻运送，-20保存备用。 1.2 酶和其他试剂 PCR 扩增试剂盒、饱和酚、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、EB、DEPC、 提取总 RNA 用 TRIzol,BioFlux 公司产品，Cycle-Pure Kit,OMEGA 公司产品。DL2000 Marker，TaKaRa RNA PCRKit(AMV)Ve
6、r.3.0 购自大连宝生物有限责任公司；其他试剂均为 分析纯试剂。 1.3 引物设计及合成根据 GenBank 上发表的 PRRSV 基因序列(AY032626;AY262352),用 Oli-go6.0 软件设计引物， 上游引物 5-AGAACTGTGACAACAACGCTG-3，下游引物： 5-GAGTCGATGATGGCTTGAGCT-3，扩增缺失株（高致病性 PRRSV 毒株）和非缺失株 （经典 PRRSV 毒株）预期扩增产物长度分别约 263bp 和 350bp。由宝生物工程(大连)有限 公司合成。 根据已发表的 PCV-2 核酸全序列合成了 1 对特异性的 PCR 引物。上游引物:
7、5-CAGCAAGAAGAATGGAAGAAGCGGA-3:下游引物:5- CCAGGACTACAATATCCGTGTAACT-3。扩增目的基因片段长为 1057bp，引物由宝生 物工程(大连)有限公司合成。 参考 GenBank 中公布的猪瘟病毒（CSFV） ，石门（shimen）株基因组，设计合成了 1 对 CSFV 特异性的引物 Csfv-F：5-AAGTAACAGAGACATGAATGG-3Csfv-R：5-CCAAAAGGATAGGTAGGGT-3由宝生物工程(大连)有限公司合成。 1.4 病料处理及 DNA 的提取 将组织样品称量、研磨，制成匀浆后反复冻融 3 次，取上 清液按照常
8、规方法提取样品总 DNA 参照文献10 1.5 RNA 的提取及 cDNA 合成 参照文献111.6 PRRSVRT-PCR 反应 按下列组成配制 PCR 反应体系 25L：RnaseFree ddH2O 10.5L，MgCL2(25mmol/L) 5L，dNTPMixture：2.5L，10One Step RNA PCR buffer2.5L，引物(20pmol/L)F2923 0.5L、R3272 0.5L，AMV Reverse Transcriptase XL 0.5L，AMV-OptimizedTaq0. 5L，Ranse Inhibitor0.5L，模板 2L。反应条件为：503
9、0 min，942 min。9430 s，5830 s，7245 s，共 40 个循环；72延长 10 min。1.7 PCV-2PCR 反应 按下列组成配制 PCR 反应液：10PCR Buffer 1.5L，ddH2O 10.4L，MgCL2(25 mmol/L) 1.5L，dNTPs(10 mmol /L)0.3L，Taq DNA 聚合酶 0.2L，上下游引物(20mol/L)各 0.3L，DNA 模板 0.5L；共 15L。将上述反应液加入到 PCR 反应管中，轻轻混匀。PCR 反应条件为：94 5 min；94 30 s、55 30 s、72 45 s，35 个循环；72 10 mi
10、n。1.8 CSFVRT-PCR 反应 按下列组成配制 PCR 反应液：10PCR Buffer 1.5L，ddH2O 10.4L，MgCL2(25 mmol/L) 1.5L，dNTPs(10 mmol /L)0.3L，Taq DNA 聚合酶 0.2L，上下游引物(20mol/L)各 0.3L，cDNA 模板 0.5L；共 15L。将上述反应液加入到 PCR 反应管中，轻轻混匀。反 应条件：94预变性 12 min；然后 9445 s、5545 s、721 min，扩增 35 个循环；最后 72延伸 10min。 1.9PCR 产物鉴定 用 1%琼脂糖凝胶电泳,紫外检测仪下观察结果，以 PCR
11、 产物中出现以 PCR 产物中出现 263bp，1057 bp，602bp 条带的样品为阳性。2 防制措施防制措施 2.1 对发病较重的猪及时淘汰，病死猪深埋处理。流产母猪，同窝发病仔猪进行隔离饲养 观察。圈舍及用具彻底消毒。 2.2 对全群未发病猪用哈兽研牌猪瘟兔化弱毒疫苗（4000RID/头份）进行紧急免疫接种， 剂量为 2 头份/头（配种至妊娠 85 天母猪不免） 。 2.3 猪瘟疫苗免疫 7 天后全群未发病猪实施哈兽研牌猪蓝耳病弱毒疫苗（CH-1R 株）紧急 免疫接种，保育猪 2 头份，育肥猪、后备猪 3 头份，种公、母猪 3 头份（妊娠 80 天后重胎母猪不免） 。待疫情稳定后，种母
12、猪配种后 40 天免疫蓝耳病灭活疫苗 4 毫升/次，间隔 21 天再肌注一次。种公猪一年 2 次，每次肌注 4 毫升。另外定期监测公猪精液蓝耳病野毒感 染情况，野毒感染的公猪及早淘汰。 2.4 用哈兽研牌猪瘟兔化弱毒疫苗（4000RID/头）对初生仔猪实施超前免疫，剂量为 0.5 头份/头，50 日龄进行第二次免疫 2 头份。 2.5 全群种公、母猪，商品猪接种哈兽研牌猪圆环病毒 2 型灭活疫苗（LG 株）2 毫升， 哺乳仔猪 14 日龄免疫 2 毫升，疫情稳定后 14 日龄免疫 1 毫升，35 日龄 1 毫升。 2.6 经实验室诊断后，对该场除采取常规隔离、消毒、抗继发感染，提高饲料营养等综
13、合 防制措施外，对未发病猪群进行猪瘟疫苗，蓝耳病弱毒疫苗及圆环病毒 2 型疫苗紧急免疫 接种，使疫情很快得到缓解。 3 讨论与分析讨论与分析 3.1 根据该场临床症状，病理剖检，PCR 及 RT-PCR 技术最后确诊为 PRRSV，PCV2，CSFV 混合感染。调查其发病原因，我们发现本场 2011 年 11 月 1 日之前 猪群生产一直稳定，但是猪场分别在 2011 年 9 月下旬，10 月下旬从外场引进体重平均 100 斤左右的后备猪 106 头，未经隔离直接与本场后备猪混群饲养。外引后备猪最先发病，本 场后备猪后发病从体重 150 斤以上的开始蔓延到初产母猪，而本次疫情初产母猪流产比例
14、很高，可能是疫情发生的原因。 3.2 本场过去几年后备猪配种前一直没有进行过蓝耳病疫苗的免疫，也没有采取其他预 防措施，配过种的后备猪抗体是否转阳不清楚。是否获得坚实免疫保护不得而知。后备猪 与外引猪，后备猪与经产母猪等不同猪群混群恰恰增加 PRRSV 交叉感染的机会。如果母 猪接种疫苗前就存在 PRRSV 持续感染，病毒血症。再使用蓝耳弱毒疫苗采用“一刀切免 疫” ，就会增加母猪发病的风险，最近几年关于给妊娠后期母猪接种蓝耳病活疫苗导致猪群 发病的病例屡见不鲜。所以笔者建议待猪群稳定后给种猪群接种蓝耳病灭活疫苗，更安全， 3-4 周龄健康仔猪接种蓝耳病活疫苗，可有效降低仔猪水平感染发病的风险
15、。 3.3 检测 6 头仔猪中，3 头哺乳仔猪日龄均在 10 日龄以内。检测出 PRRSV 可见母猪经 过胎盘垂直感染的可能性最大。经胎盘垂直感染新生仔猪，导致新生仔猪肺脏，脾脏等器 官受损严重12。所以要高度重视猪场种猪群选留和免疫。 3.4 临床上出现一定比例哺乳仔猪、保育仔猪肌肉震颤，并伴有一定比例死亡，活下来 的猪到保育阶段仍有肌肉震颤现象，经过诊断为猪瘟野毒感染（2/6)，本场尽管免疫了猪 瘟疫苗但出现免疫失败，笔者认为可能有两个原因：一是本场是蓝耳病，圆环病毒阳性场， PRRSV，PCV2 持续感染，造成猪免疫抑制，影响疫苗效果。二是本场一直采用猪瘟普免 的方式来免疫疫苗，一年 3
16、 次免疫，如果不定期监测猪瘟抗体水平，依靠经验无法判断猪 群的免疫水平。 3.5 从本场检测结果（3/6)，PCV2 感染阳性率相当高，特别是保育仔猪阶段最严重，说 明这个病毒在猪群中普遍存在和流行。带毒猪长期排毒，威胁其他猪的健康，单一感染猪 缺乏典型的临床症状与病理变化，与 PRRSV 共同感染能引起仔猪断奶后多系统消耗性综 合征，表现为淋巴组织肿大、出血，肉芽肿性炎症，坏死性肝炎，仔猪消瘦、生长缓慢等 特征性病变；混合感染能加重 PRRSV 对仔猪引起的间质性肺炎的严重程度13，另外学者 研究表明 PCV-2 的感染会对猪的免疫系统造成损害从而抑制猪瘟疫苗的免疫效果14。而 应用 PCV2 疫苗是预防圆环病毒 2 型感染，降低免疫抑制的主要手段之一，哈尔滨兽医研 究所刘长明15对我国部分
