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1、华中科技大学博士学位论文表观遗传修饰在胰岛分化及其相关基因转录表达的作用研究姓名：李明岳申请学位级别：博士专业：普通外科指导教师：王春友;余小舫2010-05-24华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 1 摘摘 要 要 目的 目的 研究表观遗传修饰在胰岛分化及其相关基因（Pdx-1、Pax4、MafA和 Nkx6.1）转录表达的作用。 方法方法 培养及收集小鼠胚胎干细胞(mES) (1107)、小鼠成纤维细胞株 NIH3T3 细胞(1107)和小鼠胰岛素瘤细胞株 NIT-1 细胞(1107)三种细胞，采用甲基化 DNA 免疫共沉淀实时定量
2、 PCR 法(MeDIPqPCR) 检测 3 种细胞中与胰岛分化相关的基因、Oct4 基因和 MLH1 基因的转录起始区 DNA 甲基化水平，采用染色质免疫共沉淀实时定量 PCR 法(ChIPqPCR)检测上述三种细胞各基因转录起始区组蛋白修饰（H3 乙酰化、H3K4m3 和 H3K9m3 修饰）的状况，同时采用实时定量 RT-PCR 检测上述三种细胞各基因 mRNA 表达水平，分析 DNA 甲基化、H3 乙酰化、H3K4m3 和 H3K9m3 修饰改变与基因表达之间的关系。 结果结果 （1）NIH3T3 细胞 Pdx-1、MafA 和 Nkx6.1基因转录起始区呈高甲基化，与 mES 和 N
3、IT-1 细胞相比均明显增高(P0.05)，与基因表达存在负相关； （2）NIT-1 细胞中 Pdx-1、Pax4、MafA、Nkx6.1 等基因转录起始区的 H3K4m 的修饰水平较 mES 和 NIH3T3细胞明显增高(P0.05)，基因表达。 （3）NIH3T3 细胞中 Pdx-1、Pax4、MafA、Nkx6.1 等基因转录起始区的 H3K9m3 的修饰水平较 mES 和 NIT-1细胞明显增高(P0.05)，基因不表达。结论结论 组蛋白修饰（H3K4m3 和H3K9m3） 及 DNA 甲基化能相互协调， 共同参与了 Pdx-1、 MafA、 Nkx6.1和 Pax4 等与胰岛分化相关
4、的基因的表达调控，对胚胎干细胞向胰岛分华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 2 化具有重要的意义。 【关键词】DNA 甲基化；H3K4m3；H3K9m3；H3 乙酰化；基因表达；胰岛；分化 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3 ABSTRACT Objective: To study the effect of epigenetic modification on the differentiation of islet cells and the expression of a
5、ssociated genes (Pdx-1、Pax4、MafA、Nkx6.1,etc). Method: Mouse embryonic stem cells(1107), NIH3T3 cells(1107) and NIT-1 cells(1107) were cultured and collected. The promoter methylation status of islet differentiation-associated genes (Pdx-1,Pax4,MafA and Nkx6.1),Oct4 and MLH1 genes among different cel
6、l types were measured by using methylated DNA immunoprecipitation-real time quantitative PCR methods (MeDIP-qPCR). The promoter histone modification status of these genes among different cell types were measured by using chromatin immunoprecipitation-real time quantitative PCR methods. The expressio
7、n of these genes in the three cell lines were measured by realtime quantitative PCR. Analyze the relationship between the differences of epigenetic modification(DNA methylation, H3 acetylation, H3K4m3 and H3K9m3) and gene expressions. Results: (1) In NIH3T3 cell, the transcription-initiation-site of
8、 Pdx-1, MafA and Nkx6.1 are high extent of methylaion status. Compared with mES cell and NIT-1 cell, NIH3T3 cell has a sigificantly higher level of DNA methylation modification (P0.05)。(2) Pdx-1、Pax4、MafA、Nkx6.1 等胰岛分化相关的基因在 NIT-1细胞特异性高表达(P0.05)。(3)Pdx-1、MafA 和 Nkx6.1 基因的 DNA 甲基化修饰和基因表达存在负的直线相关（相关系数分
9、别为0.998，0.994 和0.999） 。Pax4 基因 DNA 甲基化修饰和基因表达无明显相关。 结论结论 DNA 甲基化通过参与 Pdx-1,MafA和 Nkx6.1 等与胰岛分化相关的基因的调控表达，从而在胚胎干细胞向胰岛分化过程中起重要调节作用。 关键词关键词 DNA甲基化；免疫共沉淀；基因表达；胰岛；分化 Detecting DNA methylation level of the islet differentiation-associated genes among different mouse cell types genes with MeDIP-qPCR. ABSTR
10、ACT Objective To explore the regulation of DNA methylation in the differentiation of islet cells and the expression of associated genes,through comparing the difference of DNA methylation modification in the transcription modification site of 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 43 several
11、 islet differentiation-associated genes (Pdx-1、Pax4、MafA、Nkx6.1,etc) among different cell types. Method: Applying methylated DNA immunoprecipitation-real time quantitative PCR(MeDIPqPCR) methods to study DNA methylation modification in the transcription initiation site of islet differentiation-assoc
12、iated genes, Oct4 and MLH1 genes, among mouse embryonic stem cells (1107), NIH3T3 cells (1107)and NIT-1 cells (1107).At the same time, to quantify the mRNA levels of these genes among the above three cell types using qRT-PCR. Analyze the relationship between the differences in DNA methylation modifi
13、cation and gene expressions. Results: (1) In NIH3T3 cell, the transcription-initiation-site of Pdx-1、 MafA、 Nkx6.1 are high extent of methylaion status. The levels of DNA methylation of these genes are 61.83%3.33%，93.66%9.29%，66.00%2.95%.Compared with mES cell and NIT-1 cell, NIH3T3 cell has a sigif
14、icantly higher level of DNA methylation modification (P0.05).(2) The expressions of islet differentiation-associated genes (Pdx-1、 Pax4、 MafA、 Nkx6.1,etc) are highly in NIT1 cells, but not in both of NIH3T3 cells and mES cells.(3) There are the Pearson correlation between expressions of Pdx-1、MafA、N
15、kx6 genes and methylation modification(Coef. 0.998，0.994,0.999). Conclusion: DNA methylation participated to regulation and control expression of islet differentiation-associated genes (Pdx-1、MafA、Nkx6) and play a important role on the differentiation of islet cells from ES cells. Key words: DNA met
16、hylation; immunoprecipitation;gene expression; islet;differentiation 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 44 甲基化 DNA 免疫沉淀法(methylated DNA immunoprecipitation,MeDIP) 是 DNA 甲基化的一种重要检测方法，能够利用抗 5-甲基胞嘧啶抗体沉淀甲基化 DNA 片段，有效地从待测样品中分离出甲基化 DNA1,2。 它的基本原理是首先采用超声仪将基因组DNA 打断，使 DNA 片段大小介于300到1000bp之间； 将断裂后的DNA片段分成两份， 一份进行免疫共沉淀反应，一份作为 input 对照(不做任何处理直接进行 PCR 反应)。在第一份DNA 样品中加入抗 5-甲基胞嘧啶抗体和携带二抗的免疫磁珠进行孵育反应，利用磁铁的吸引力将甲基化DNA 片段从待测样品分离出来。IP缓冲液洗涤， 去除未结合的未甲基化DNA 片段，蛋白酶 K 消化抗
