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1、罗汉果综合开发项目罗汉果综合开发项目 技术报告技术报告一、项目立项背景及必要性一、项目立项背景及必要性传统的罗汉果加工仅仅是对果实的提取、加工和利用，而对于其叶、藤、根、茎等非果实部分的生物活性人们知之甚少，未能有效利用。罗汉果植物在中国非常珍贵，而且只有中国适合种植这种植物，因此资源的充分利用就显得尤为重要。长期以来，罗汉果的叶和藤被当做废弃物丢弃或焚烧，这其中是否也会含有生物活性成分呢？针对这一问题，我们展开了大量的研究。我公司美国实验室研究发现罗汉果的非果实部分中不仅含有抗微生物活性成分，还有降血糖功效成分。本项目将继续深入研究如何利用罗汉果的非果实部分来制备抗微生物、降糖的提取物和药物
2、，用于保健品和药品开发。如此既能充分利用资源，变废为宝；又能降低成本，使产品在市场上更具优势。随着社会经济的迅速发展，人们生活水平的不断提高，口腔健康问题已越来越受到关注，口腔疾病的预防与治疗已成为国际医药领域的新热点。罗汉果非果实部分提取物可直接用于口腔疾病药物的终端产品生产，也可用于牙膏、口香糖等健康、保健新产品研发，这为罗汉果的深度开发利用提供了一条崭新可行的途径。另外，随着人民生活水平的不断提高，各种各样的所谓“富贵病”也在不断威胁人类健康，糖尿病便是其中的一种具有代表性的终身疾病。目前，我国的降糖市场以西药为主，约占整个市场份额的 73.68%；中成药为辅，约占24.7%。占降糖类产
3、品绝对优势份额的主要是化学类处方药，虽然效果较明显，但长期服药引起的耐药性、抗药性、肝肾损伤等都让糖尿病患者备感痛苦。罗汉果非果实部分提取物具有明显的降糖作用，且无副作用。在我市深入开展罗汉果提取物抗口腔疾病成份及其产业化应用研究具有显著的社会效益和经济效益，可成为新的经济增长点，形成新的产业集群，亦有利于推动地方特色中药资源的国际化进程。由于罗汉果藤和叶的价格低廉, 因此以之为原料制备的抗微生物的提取物和药物与其它同类产品相比具有明显的成本优势，将产生巨大的经济效益。二、项目研究的技术路线和方法二、项目研究的技术路线和方法1、项目的核心内容a、罗汉果植株提取物活性成份的提取、分离、纯化等基本
4、工艺条件和参数筛选研究，确定了生产工艺参数，实现产业化生产。b、罗汉果植株提取物活性成分药理研究，对罗汉果植株提取物活性成分进行药理研究，包括有效成分的理化性质研究、药效研究，确定其药理活性作用。c、利用罗汉果果实提取物已完成无糖甜味剂、无糖糖果等食品的开发，利用罗汉果叶、藤、根、茎等提取物的杀菌功能和降血糖功能来开发杀菌牙膏、杀菌含片和降血糖颗粒含片等保健品。2 2、项目的技术路线及实现途径、项目的技术路线及实现途径（1 1） 罗汉果植株提取物活性成份的提取、分离、纯化等基本工艺条件和参数罗汉果植株提取物活性成份的提取、分离、纯化等基本工艺条件和参数筛选研究阶段筛选研究阶段1.11.1 活性
5、成分的筛选及提取分离工艺参数的制定活性成分的筛选及提取分离工艺参数的制定 1.1.11.1.1 目的目的 从罗汉果植株中提取分离得到有抗微生物和降糖活性的成分，制定合适的工艺条件，初步筛选出活性成分。1.1.21.1.2 工艺过程工艺过程 罗汉果植株洗净、晒干称重切段90%乙醇浸提50%乙醇浸提水浸提棕褐色物质（A）棕褐色物质（B）淡黄色物质（C）浓缩乙酸乙酯浸提20%乙醇浸提1.1.31.1.3 提取溶剂的选择提取溶剂的选择罗汉果植株切段后，选用饮用水、乙酸乙酯、乙醇（20%、50%、90%）等溶剂在 60下进行提取，结果如表 1 所示：表 1 采用不同溶剂提取的效果项目粗提物性状收率（%）
6、抑菌、降糖活性结果分析水为深褐色固体物，味道苦涩22一般粗提物的收率虽然最高，但提取的溶液不易浓缩乙酸乙酯为棕黄色油状物，味道很苦6弱收率最低，溶剂易挥发，会造成很大的浪费；且粗提物为油状，较难处理20%乙醇为褐色固体物，味道稍苦20一般收率较高，但是抑菌活性不强50%乙醇为棕褐色固体物，味道微甜18较强抑菌作用较强，收率较高，且溶液容易回收90%乙醇为棕褐色膏状物味道微甜12很强抑菌作用很强，但是收率较低，浪费了药材由表 1 综合分析可知，使用不同的溶剂提取时罗汉果植株提取物收率不同，采用 50%酒精对罗汉果植株进行提取不仅产品收率高而且提取物抑菌、降糖活性作用强。1.1.41.1.4 不同
7、提取物的活性分析实验不同提取物的活性分析实验 按照上述的工艺过程，将 A、B、C 组分制成干粉后各取 50mg 溶解，并检测生物活性。按以下步骤进行：在 96 孔板中添加 100l TSBYE 培养基，按 10%接种量接种细菌后过夜培养；各取 1l 罗汉果提取物组分添加到培养基中继续厌氧培养16 到 18 小时；在每孔中添加 6l 比色对照物；活细菌在代谢时能使原是蓝色的比色对照物转换为粉色，而死细菌则不行。培养 1 小时后，在 600nm 处进行比色；活细菌代谢后转换的粉色，OD 值在 0.200 到 0.600 之间，而死细菌则不能将蓝色转换为粉色，并使 OD 值大于 2.000。接下来在
8、琼脂平板上进一步检测其抗菌活性；确认蓝色孔中添加的罗汉果提取物具有杀死细菌特性；将这些提取物稀释 10000 倍后添加到琼脂平板；阴性对照则不添加任何具有抗菌活性的物质；涂布平板后在 37厌氧条件下培养 48 小时；计算平板上的菌落数。实验结果见下图 1：图 1：罗汉果植株浸提物对变异链球菌生长的影响。各组分由其浸提使用的溶剂标明。对照实验只将变异链球菌接种在琼脂平板上，不添加提取液组分。平板上的菌落数用CFU（菌落形成单位）表示。结果表明：经过 50%乙醇浸提获得的浓缩提取物具有较高的抑菌活性。1.1.51.1.5 选择不同树脂分离活性物质选择不同树脂分离活性物质用 500g 等量的 D10
9、1 树脂、聚酰胺树脂、硅胶分别装填层析柱，用乙醇浸泡 1 天，用蒸馏水洗净其中的乙醇。称取罗汉果植株用 50%乙醇热提，浓缩，取 1 升等体积的罗汉果植株浓缩浸提液（相当于罗汉果植株 1.0Kg）分别上柱，洗脱，收集洗脱液，干燥获得样品。表 2：不同树脂的提取物收率 项目D101 树脂聚酰胺树脂硅胶 植株提取物（g）37.528.321.2 收率%3.72.82.1由表 2 可以看出 D101 大孔树脂吸附获得的样品得率最高。1.1.61.1.6 罗汉果植株罗汉果植株( (叶、藤、根）活性成分的分离纯化叶、藤、根）活性成分的分离纯化1) 取罗汉果植株洗净，切段，用 50%的酒精 60浸提三次，
10、每次 1 小时，将溶液浓缩，呈深黄色浓缩液.2) 将 D101 大孔吸附树脂用乙醇浸泡一天，装柱，用蒸馏水洗净其中的乙醇。3) 将浓缩液上大孔吸附树脂柱，先使其自然流下，再用蒸馏水洗到颜色近无色，此段时间所收集到溶液为柱流液(EL)(没有被大孔吸附脂所吸附的那部分溶液).再用 10%到 100%乙醇进行梯度洗脱，每个梯度洗脱 1 小时，同时收集每个阶段的洗脱液（GL).4) 罗汉果植株洗脱液的生物活性检测 将各洗脱液浓缩，干燥后各取 50mg溶解，检测生物活性，结果如下：Antibacterial activity of LHK leaves0100200300400500600Control
11、10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%Amberlite fractionsCFU图2：罗汉果叶提取物对变异链球菌生长的影响。amberlite 层析柱的回收组分由其乙 醇浓度标明。对照实验只将变异链球菌菌接种在琼脂平板上，不添加提取液组分。平板上 的菌落数用 CFU 表示。Antibacterial activity of LHK root extract0100200300400500600700Control10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%Amberlite fractionsCFU图 3：罗汉果根提取物对变异链球菌生长的影响。amb
12、erlite 层析柱的回收组分由其乙醇浓度标明。对照实验只将变异链球菌接种在琼脂平板上，不添加提取液组分。平板上的菌落数用 CFU 表示。5) 结果实验显示罗汉果植株提取物的抗菌活性与阴性对照相比，70%到 100%浓度的乙醇溶液洗脱的回收液具有最强的抗菌活性。1.1.71.1.7 罗汉果植株提取物中山柰苷的分离纯化罗汉果植株提取物中山柰苷的分离纯化将所得到的罗汉果植株提取物溶解到水中，依次用己烷（5 次） ，乙酸乙酯（5 次）和正丁醇（5 次）萃取，所得的正丁醇萃取液减压浓缩得到褐色膏状物，水溶后上大孔吸附树脂柱（Amberlite XAD16）分离，依次用 50%、70%的乙醇洗脱，收集
13、70%乙醇洗脱液浓缩，得到黄色针状结晶。山柰苷暗黄色针状晶体，C27H30O14，结构式如下：OOOOHOOHOOHOHOHOOHOHOH山柰苷化学分子式 根据产品特点和性质，我们确定了如下的技术方案：该项目方案围绕产品优质化，市场利用价值更高，通过不断优化，以期从罗汉果植株中得到提取物更高的收率，及提取物中山柰苷的含量更高。首先，对本项目所采取的主要工艺进行选择，通过对水煮法、醇沉法、大孔树脂吸附技术纯化方法进行了比较，结果如表 3。表 3：提取溶媒的选择指标检测方案设计活性筛选技术参数工艺流程规模生产产品定型技术鉴定中试生产图 4 项目技术方案图由上表可以看出，大孔树脂吸附提取纯化技术优势
14、多，为目前中药提取纯化的先进技术，且工业运用也比较成熟。大孔树脂吸附技术，近年来在天然药物化学成分的提取、分离纯化、制剂工艺改革、制剂质量分析等方面都有了应用研究，明确显示出其独特的作用。利用大孔吸附树脂的多孔结构和选择性吸附功能可从中药提取液中分离精制有效成分或有效部位，能很大限度地去粗取精。与中药制剂传统工艺比较，应用大孔吸附树脂技术所得提取物体积小、不吸潮、易制成外型美观地各种剂型，特别适用于颗粒剂、胶囊剂和片剂，改变了传统中药制剂的“粗、黑、大”现象，有利于中药制剂剂型的升级换代，促进了中药现代化研究的发展。在确定使用大孔树脂吸附技术后，我们开始对小试的工艺步骤进行了设计审查，安排如图
15、 2。一般水煮法水提醇沉法大孔树脂吸附法所得产品中黄酮的含量25%10%左右30%以上优缺点工艺简单，但所得产品成分复杂，质量不易控制，浓缩时所耗能源较多所需要的溶剂量大，且所得的产品纯度不高，质量不易控制产品中黄酮含量高，所用的溶剂食用酒精可以回收重新再利用罗汉果植株切段 duan 浸提浓缩过柱洗脱浓缩最优条件过滤指标检测小试的主要目是确定大孔树脂吸附技术工艺最优化的生产参数，这些参数有：a、药材浸提时，所使用的溶剂及所使用溶剂的浓度；b、采用大孔树脂吸附时，大孔树脂的型号选择；c、洗脱溶剂的选择和洗脱时间，有效成分在哪个溶剂浓度下被最有效的洗脱出来；d、此外还考虑工艺温度、浸提液上柱速度，
16、溶剂的洗脱速度以及药材的破碎大小等因素对罗汉果植株提取物产品质量的影响。（2 2 ）罗汉果植株提取物活性成分药理研究阶段）罗汉果植株提取物活性成分药理研究阶段罗汉果植株提取：罗汉果植株提取：取 100 公斤罗汉果藤和叶，粉碎以后用 500L50%的乙醇煮 60 分钟，然后重复 3 次。合并提取液，蒸发掉乙醇，过滤，滤液留待下一步纯化。将约 100 升的滤液通过一个 40 升的预先与水平衡的非极性的 amberlite 树脂柱。然后用200L 水来冲洗，洗掉没有被树脂柱吸附的物质。该柱分别用 40L10%、20%、40%、60%、70%、85%、95%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱组分并干燥，做生物活性分析。2.12.1 抗菌活性抗菌活性得到的罗汉果叶和茎的乙醇提取物各50mg,分别溶于1mL无菌水中,使其充分溶解,用细菌过滤器过滤,取200L样品溶液以相应的液体培养基倍比稀释成样品浓度分别为50.00mg/mL、25.00mg/mL、12.50mg/mL、6.25mg/mL,每管
