结核病的实验室诊断方法及评价

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1、1耐多药结核病的实验室诊断条件耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性， 1） 需 P2 及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行， 2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障， 应定期予以更换。耐多药结核分枝杆菌主要以耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。因此其基 础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测 定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。 1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用 BA

2、CTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII 等仪器系统快速检测结核分枝杆 菌的药物敏感性。其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我 国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制 99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生 组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示 细菌生长状况。 2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests 法、噬菌体生物扩增 法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。 3 分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。基因突

3、变是引起抗 结核药物耐药性的最主要的原因。多种以 PCR 为基础的分子生物学技术用于检测与耐药 相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。这些方法具体包括： 主要是 DNA 序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP） ，另外还包括 基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA 错配检测技术和分子灯塔技术等。由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完 全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突 变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法 不

4、能完全替代表型鉴定法。结核病的实验室诊断方法及评价结核病的实验室诊断方法及评价(一)标本的采集 1痰标本采集 新发病人应在抗结核药物治疗前留取痰标本。治疗中的病人应停药 23 天后留取痰标本。病人于清晨漱口后，留取 35ml 合格的痰标本(深咳后吐出的黏液 痰、脓样痰、干酪样痰、褐色血样痰或含少量新鲜血液的血痰)，遇到唾液或口永，应重新 留取。至少采集 3 次。WHO 推荐的采集容器为国际通用的螺旋盖痰瓶、可密封塑料盒或 蜡纸盒。痰容器上应标明病人姓名、编号、检查项目和容器序号。 2.胃冲洗液 幼儿不会吐痰，常将痰液咽下，故可用清晨空腹胃洗出液，直接涂片染 色或进行结核杆菌培养，连续作三次可提

5、高培养阳性率。胃液结核杆菌检出率以浸润性肺 结核和干酪性肺炎为最高，其次为粟粒型肺结核。胃液、痰液或其他分泌物中结核杆菌检 查，有时对诊断有决定性意义。 3.支气管肺泡灌洗和支气管冲洗支气管肺泡灌洗和支气管冲洗液至少 5ml 并以无菌容 器盛装，以用于检验。 4.病灶组织或干酷块等 先用组织研磨器磨碎后再行涂片。 5尿液 留全量夜尿，静置 4 或 5 小时后，弃上清液，取沉淀部分尿液 10ml，3000rpm离心 30min，取沉渣涂片。 26.体液或脑脊液 无菌操作收集体液或脑脊液，放置冰箱或室温 24h，待薄膜形成后涂 片。也可将脑脊液离心沉淀，3000rpm，离心 30min，弃上清液，

6、取沉淀物涂片。 (二)试验方法及评价 1细菌学诊断方法 (1)涂片检查法：包括直接涂片法、荧光染色涂片法和集菌涂片珐。痰液、脓液可直接 涂片。用萋尔-尼尔逊染色法(Ziehi-Neelsen)简称萋尼染色法，若镜检找到抗酸性杆菌，则 可能是结核杆菌。此法简便、快速，技术要求低，无需特殊仪器且能当天出结果，十分经 济，符合我国国情。但其敏感性差，一般需 500010000 条菌ml 才能得到阳性结果；特 异性差，各种分枝杆菌均可着色，要进一步鉴定是否为结核分枝杆菌；不能区分死菌与活 菌。 【萋尼氏染色法】 涂片：取经 95乙醇擦拭脱脂过的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻璃片(玻片 不能重复使用)

7、，于玻片背面的左端 13 处以蓝色或黑色记号笔(玻璃铅笔)编号。用接种环 挑取痰标本的脓样，干酪样部分约 0.050.1ml，于玻片正面的右侧 23 处，均匀涂沫成 10mm20mm 的卵圆形痰膜，自然干燥后待检。 试剂： 碱性复红乙醇染色储存液： 碱性复红液：8 克碱性复红溶于 95乙醇 100ml 中。 5石碳酸水溶液：5 克石碳酸溶于 100ml 蒸馏水中。 染色步骤； 【荧光染色法】 试剂： 染色剂 z 金胺“O”01g 溶于 95乙醇 10ml，加 5石炭酸 90ml。 脱色剂：3盐酸乙醇液。 复染剂：0.5高锰酸钾水溶液。 染色步骤： 镜检与报告方式：在暗色背景下，抗酸杆菌呈黄绿色

8、或橙色荧光。必须用 40物镜 确认菌体形态，应具有萋-纳氏抗酸染色镜经检验后，方可应用荧光染色法，注意勿过读或 漏判。荧光染色后涂片应在 24h 内检查，遇需隔夜时，置 4保存，次日完成镜检。 物镜 20检查结果按下列标准报告： 阴性(-)：0 条50 视野 可疑(+)；13 条50 视野 阳性(1+)：l199 条50 视野 (2+)：19 条每视野 (3+)：1099 条每视野 (4+)：100 条每视野 物镜 40检查细菌细胞形态。 (2)常规培养法：结核分枝杆菌培养阳性是确诊结核病的“金标准”。改良罗氏培养法是 目前较为成熟的分离培养方法，根据结核杆菌生长缓慢，菌落干燥、颗粒状、乳酪色

9、像菜3花状，菌体染色抗酸性强等特点判断是否为结核杆菌。如菌落、菌体染色都不典型,则可能 为非典型分枝杆菌，应进一步作鉴别试验。此法培养时间长，不适于快速检测结核杆菌， 且阳性率也只有 3040，使大量结核病人漏诊或误诊。同时各种分枝杆菌均可生长， 也需进一步鉴定是否为结核分枝杆菌。 培养结果报告方式： 抗酸杆菌培养阴性：斜面无菌落生长。 抗酸杆菌培养阳性(1+)：菌落生长占斜面面积的 14。 抗酸杆菌培养阳性(2+)：菌落生长占斜面面积的 12。 抗酸杆菌培养阳性(3+)：菌落生长占斜面面积的 34。 抗酸杆菌培养阳性(4+)：菌落生长布满全斜面。 抗酸杆菌培养阴性应以“(培养阴性)”报告。

10、菌落生长不足以斜面面积 14 时，实报菌落数。 (3)快速培养法：BactecMGIT960 分枝杆菌快速培养、药敏检测系统的基本原理是， 其所使用的培养瓶底部含有包被于树脂上的荧光显示剂，由于该显示剂为氧抑制性，当分 枝杆菌生长使氧消耗后，荧光显示剂被激活而发出荧光。检测系统每隔 60 分钟连续测定培 养管内荧光强度，来判断管内分枝杆菌生长情况。BacTALERT3D 培养系统：是另一类 分枝杆菌快速培养、药敏检测系统，也可用于普通细菌的培养。其原理是所使用的培养瓶 底部，有颜色感应器，当分枝杆菌在瓶中生长，有 CO2 产生时，颜色感应器由绿色变为黄 色。系统自动连续检测数据输入计算机，根据

11、计算结果自动显示有无分枝杆菌生长。此法 无放射性，显著缩短培养时间，且操作简便、自动化强，还可进行快速菌型鉴定。但液体 培养基中不能观察菌落形态，仪器与试剂价格较贵。 (4)液体变色培养基(MBRedox 系统)：该系统由改良米氏 7H9 培养基、促生长添加剂 (血清、复合维生素等)、抗生素混合物 PACT(多黏菌素 B、两性霉素 B、茶啶酸、甲氧苄 胺嘧啶)和氧化还原显示器(即无色四鎓盐)组成。促生长添加剂可加速分枝杆菌的生长和甲 臜(formazan)的形成。其原理是当分枝杆菌在此培养基生长时，通过氧化还原系统，使培养 基中的无色四唑鎓盐还原成粉红色、红色或紫色甲臜。由于甲臜不溶于水以颗粒

12、形式分 泌到细胞表面，分枝杆菌菌落就变成了用肉眼可见的红或紫色，取培养液涂片，染色镜检。 此法操作简便，培养时间短，肉眼观察结果，无需特殊仪器，无放射性污染，还可用于分 枝杆菌的药敏试验和菌种鉴定。但阳性率还不够高，结果观察存在主观性。 (5)噬菌体裂解试验：由于耻垢分枝杆菌噬菌体是一种 DNA 病毒，能特异感染相应的 活的分枝杆菌，并在菌体内迅速增殖?裂解菌体，释放出的子代噬菌体，又可感染随后加入 的指示细胞(也是一种分枝杆菌)，并使指示细胞裂解，在培养平板上出现噬菌斑。根据噬 菌斑的有无，即可确定待检标本中是否含有相应的活的分枝杆菌。此方法简便、快速，不 需特殊仪器；特异性和灵敏度较高；

13、检测的是活菌，但传染性小；可相对定量可测定药物敏感性。 其主要步骤为：标本前处理：同常规培养法(若用菌株则勿需此步)，经前处理后的 标本于 Middlebrook7H9 培养基中(含有改良的 OADC 营养添加剂)37温育 24h。噬菌体 浸染：取 0.5ml 上述处理后的样品(或菌液)，加入 01ml 分枝杆菌噬菌体，震荡混匀，37孵育 1b。中止浸染：于上述浸染液中加人 0.1ml 杀毒剂，彻底混匀，室温作用 5min，加入 5mlMiddlebrook7H9 培养液和 1ml 指示细胞。浇注平皿和培养：将上述混合 培养液与 5ml 溶化的琼脂共同倾注于无菌平皿中，旋转混匀，静置成形后，于

14、 37培养 1824h。每次检测同时设空白对照、嘴菌体对照、杀毒剂对照、指示细胞对照和阴性及阳 性对照。结果观察：在各对照组结果正确的条件下，观察试验样品结果。阳性结果可见 有大小和数量不等的噬菌斑出现(彩图 2)，或许多嘴菌斑相互融合成透明状；阴性结果可见4指示细胞在琼脂培养基中均匀生长无噬菌斑出现。 2常用的免疫学诊断方法 (1)酶联免疫吸附试验(enzymeLinkedimmunosorbentas-say，ELISA)：ELISA 是结核抗体。研究和应用报道最多的实验方法。 ELISA 间接法：其基本原理是吸附在固相载体上的结核抗原可与待检标本中的结核 抗体结合，形成抗原-抗体复合物，

15、后者与酶标记的抗人 IgG 结合，形成抗原-抗体-酶标抗 体复合物，酶使底物显色。颜色的深浅与待检标本中的结核抗体含量成正比。本法主要用 于测定结核抗体。 双抗体夹心 ELISA：其原理是吸附在固相载体上的结核抗体可与待检标本中的结核 抗原结合，形成抗体-抗原复合物，后者与酶标记的结核抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗 体复合物，酶使底物显色，颜色的深浅与待检标本中的结核抗原含量成正比。本怯主要用 于特异性结核抗原的测定。 抗原竞争 ELISA：其原理是吸附在固相载体上的结核抗体，可与标本中的待检结核 抗原及同时加入的酶标的结核抗原发生竞争结合，形成抗体抗原和抗体-酶标抗原两种复合 物，后者可使

16、酶作用的底物显色，颜色的深浅与待检标本中结核抗原的含量成反比。本法 主要用于小分子抗原的测定。 (2)生物素-亲和素-酶免疫测定法(biotin-avidin-system，BAS-酶免法)：基本原理类似于 ELISA，只是用 BAS 来标记酶，而不是用抗体或抗原标记酶。BAS 有三种基本测定方法， 分别称 ABC 法(avindin-biotin-complex)。BA 法(biotin-avidin)和 BAB 法(bridged-avdin- biotintechnique)。前二种方法主要用于结核抗体或抗原的测定，BAB 法主要用于免疫组化 和免疫病理中，操作较为繁琐。 (3)斑点酶免疫渗透试验(dotimmunoenzymefiltrationassav，DIEFA)：是在酶免疫结合试 验基础上发展起来的一种固相标记免疫测定技术。其原理是利用微孔膜的可滤过性，使反 应溶液自膜上迅速通过，从而完成抗原、抗体的快速测定。本法包被所需的抗原量少，预