线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的手术操作

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1、线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的手术操作线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的手术操作1 切口位置的选择 恰当切口位置的选择,可以使血管暴露充分,有利操作,节约手术时间,减少对 动物的刺激,提高术后生存率。目前国内外学者 1 ,2 多采用颈部正中切口, 国内一些学者 3 ,4 经改良后采用颈部旁侧手术入路。我们在操作中发现, 采用颈部旁侧切口不用切开颈阔肌,出血少,便于肌肉分离,手术视野暴露较好, 颈内外动脉及其分支的分离易于进行,尤其是分离深在鼓泡处的颈内动脉( ICA) 分支翼腭动脉( PPA) ,如果采用颈部正中切口由于距切口处远而难以分离另外 颈部旁侧入口对气管刺激性小,呼吸道分

2、泌物少, 不易出现呼吸道分泌物过多和 气管痉挛,手术大鼠病死率低。我们体会采用颈部旁侧手术入路应注意几点,一 是中间稍偏 015 cm 即可,切口线正好在颈阔肌和胸锁乳突肌夹隙上方,如果太 靠外侧会给分离肌肉带来难度;二是用手术刀切开皮肤时不宜用力太猛,颈侧部 静脉血管丰富,切入太深容易引起出血,给手术操作带来一定难度,以刚刚切开皮 肤为度,并且切口从上到下稍微斜向内侧,并且切口尽量靠上一些,有利于分离颈 外动脉。 2 寻找血管的方法 大鼠颈总动脉(CCA) 位于颈阔肌和胸锁乳突肌之间,上升至甲状腺水平高度 分出颈内动脉 ICA 和颈外动脉( ECA) 。ECA 在下颌角平面以下分出枕动脉、

3、甲状腺上动脉、咽升动脉、腭升动脉和上颌外侧动脉,在耳下方分出终末支即耳 后动脉、颞浅动脉和舌动脉。ICA 在鼓泡和枕骨之间入颅,在鼓泡内侧发出颅外 分支 PPA(相当于人类上颌动脉) ,主干继续沿鼓室内侧延伸,进入鼓室与枕骨基 板之间的后破裂孔进入颅腔。选择旁侧手术入路,切开皮肤暴露组织后,用止血 钳钝性分离表层软组织和脂肪组织,然后用止血钳插入颈阔肌和胸锁乳突肌之间,并 分离之,用镊子翻开颈阔肌即可看到 CCA ,仔细向远心端分离出颈内外动脉的分 叉处, 朝上走行的是 ECA ,朝下内方走行的是 ICA ,继续沿 ICA 分离,位于鼓泡 的后缘可分离出 PPA。尽量在肌肉的夹隙中剥离,减少对

4、肌肉的撕裂,保护血管 附近的神经组织。我们在实验中发现,有些造模后的大鼠手术侧出现上肢瘫痪, 这与暴露血管时损伤臂丛神经有关,因此应尽可能的保护血管周围的组织,尽量 小心剥离相关组织而不要撕裂。 3 栓线位置的选择 寻找并分离 CCA、ICA、ECA 后,阻塞大脑中动脉的血流,在栓线位置的选择 上,最早的国外一些学者 1 采用 ECA 栓线,具体方法是从 ECA 上剪一小口把 鱼线从剪口处插入,绕过 ICA、ECA 分叉处,插入 ICA 或直接剪断 ECA 插入栓线。 经 ECA 插线有两个不足 5 ,一是剪断 ECA 对实验动物的损伤太大,若不剪断,游 离 ECA ,该动脉与 ICA 之间的

5、角度太小(28125 1137) ,线栓不易进入 ICA , 而且 ECA 比较细,剪口很难把握,稍微不注意易把动脉剪断,再灌注取出栓线时 由于心脏压力较大,很容易造成内出血导致动物死亡;二是经此处插线,到达大脑 中动脉的距离较长,相应的线栓较长,操作时间较长。操作时间过长会刺激血管 壁,再灌注时容易形成血栓。国内一些学者 3 经改良后有人采用在 ICA、ECA 分叉处栓线,即在 CCA 末端剪一小口把线插入,有人研究 5 发现该动脉末端 附近有颈动脉窦和颈动脉小球,这种方法操作不慎容易引起实验动物血压升高和 呼吸异常。并建议经 PPA 根部插线,一是鼓泡可以作为手术操作的标志;二是其 管径粗

6、,与 ICA 之间的角度也大,也可缩短操作时间,减少对血管壁的刺激。但是我们认为栓线须经 PPA 根部插入,因大鼠的解剖特点是:手术视野小,分离难 度大,易出血,且需要显微器械,因此对技术要求高。4 栓线的具体方法 切开皮肤皮下组织,暴露二腹肌肌腹和胸锁乳突肌,寻找到 CCA ,分离 CCA 并保护迷走神经节,结扎 CCA 近心端,向上分离右 ECA 与 ICA ,用小血管夹夹住 CCA 远心端(CCA 结扎处与上血管夹处保持 5 mm 左右距离) ,在此处放置一打好 结的备用丝线,勿收紧线结,在此线下端剪一小口,插入已制备好的栓线头端,收 紧线结,松去血管夹,在近 CCA 分叉处用眼科镊暂时

7、夹闭 ECA ,同时顺 CCA 经 ICA 将栓线送至颅内,遇阻力而止。我们省去了结扎 ECA 而是暂时夹闭 ECA ,这 样减少了因结扎 ECA 带来的损伤,提高了术后生存率,并节约了时间,大约 10 分 钟就可以完成一只造模。有关是否结扎 PPA ,很多学者有不同意见。PPA 是 ICA 的颅外分支,它接近颅底,位置较深,在线栓制作大鼠 MCAO 模型的手术过程中, 处理起来很困难。在制作成年大鼠的 MCAO 时,多采用结扎 PPA 的方法。并且 PPA 结扎与否是影响模型成功率高低的重要因素 7 。但有人认为在成年 SD 大鼠的 MCAO 过程中可以不必结扎 PPA ,采用盲插的办法,躲

8、开 PPA 直接进入颅 内 8 。这种方法减少了手术的创伤,是一种较理想的制作永久性 MCAO 的方 法。另外一位学者发现结扎 PPA 会造成 ICA 的血栓给再灌注造成困难,提出了 暂时夹闭的观点 9 。王春霞等 3 认为无需结扎 PPA ,可提高再灌注成功 率,有实验表明 10 ,结扎 PPA , ICA 内的栓线易形成血栓,至管壁闭塞,再 灌注时难以保证正常供血,且 PPA 不是基底节区侧枝循环的主要供应血管,结扎 与否并不影响脑梗死体积和神经缺失症状。我们在实验中发现大鼠的 PPA 几乎 与 ICA 直径相当,如果不处理,误插入 PPA 的机率很大,而且反复调整栓线易造 成插线穿破 I

9、CA ,有脑出血之虞,于是不分离结扎 PPA ,只要技术熟练并注意掌 握 PPA 从 ICA 中分出的角度就不会把鱼线误导入 PPA。因此我们根据参考文献 8 的方法, 当遇到无论如何也无法插入时,就选择继续向上分离 PPA ,挂线后 采用了暂时阻断的办法,虽然操作上有一些难度,但弥补了上述方法的不足之处。 在线栓法手术过程及术后麻醉期,大鼠呼吸功能抑制,呼吸道反应差,颈部手术过 程中对呼吸道压迫及对支配相关神经损伤易使痰液阻塞呼吸道而出现呼吸困难, 甚至窒息,可进行吸痰处理并尽量避免刺激神经。 5 栓线的深度 栓线深度过深会导致动物死亡,不足又无法造模成功因此栓线深度至关重要。 一般报告认为

10、从 ECA 或 CCA 分叉处插入,其深度为(18 015) mm;曹勇军 11 在 实验中测量发现,经 CCA 插入的栓线长度为(23 015) mm 比较适宜,而经 ECA 插入的栓线长度为(20 015) mm 比较适宜。因为大鼠的体重与血管 MCA 长度 呈正相关,并且大鼠的体重与栓线直径之间有正交互作用,因此栓线的长度、直 径要与大鼠的体重相匹配。在对理想栓线探讨的实验中,关云谦 12 等发现: 进入 ICA 的尼龙线深度超过 1819 mm 可致使颅内 Willis 环的血管被尼龙线 刺破而形成蛛网膜下腔出血(SAH) ;辛世萌 13 在实验中找到的最佳匹配方案 为:大鼠体重 25

11、0330 g、线长 17 mm 或 18 mm、栓线直径 0128 mm ,该方案制 作的 MCAO 模型成功率高、重复性好、生理指标影响小,并且发现栓线插入长度 17 mm 或 18 mm 对造模效果的影响没有统计学上的差异。综合不同的研究结果,对 于体重适宜造模的大鼠,理想的栓线长度为 1718 mm;我们在栓线深度上用有 色笔在栓线的 20 mm 处做标记,直到把有颜色的标记送入分叉处,才能保证栓线深度,这时感觉有阻力时即停止插入,并向外稍拉出一点即可。 6 术后处理 由于术后动物尚未清醒,因此护理也很重要。但为保证栓线成功,达到预期的 阻塞时间,防止栓线脱落暂时把动物留在手术台上,保证

12、动物不会因挣扎而把栓 线过早脱落,但仍需监测体温,并注意保暖。再灌注后动物可放入笼中。另外笼 中应保持干燥,没有积水及粉尘,防止动物误吸而窒息。我们在实验中发现一些 模型症状不典型甚至没有症状,都是由于动物苏醒后极力挣扎使栓线过早脱落所 致。手术后大鼠存活期可以满足通常的实验需求,一般来讲,随着栓塞和再灌注 损伤时间的延长,死亡率会上升。大鼠在术后 2448 小时最容易死亡,这种死亡 是严重脑缺血损伤造成的,较直接的因素是脑水肿。用线栓制作持续性局灶性脑 缺血模型时,术后要肌注庆大霉素预防感染;如果动物模型要生存 1 周以上,必要 肌注速尿,防止因脑水肿动物在短期内死亡。术后饮水中加入葡萄糖,保证动物 术后有充足的能量生存到实验要求的时间。线栓法模型制备的手术操作过程中, 鱼线入颅后的操作是非直视下进行的,血流阻断与否无法直接判断。制备该模型 时切口位置的选择、血管的寻找、栓线位置、栓线的具体方法、入线深度等都 需要进行相应调整,其中任何一个环节配合不好,都会导致模型失败,使缺血发生 率降低。因此,模型的操作需要一个熟练过程,只有熟练手术操作者才能复制出 稳定的梗死灶。