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1、PCR 反应不理想的几种原因和对策反应不理想的几种原因和对策假阴性，不出现扩增条带 PCR 反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有 Taq 酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化 除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸 变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核 酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更 改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶
2、的活性丧失或不够而 导致 假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不 理 想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条 浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓 度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且 两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做 PCR 有可能 失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平 衡其浓度。引物应高浓度小
3、量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引 物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特 异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或 100ul，应用多 大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后， 再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温
4、度低，变性时间短，极有可能出 现 假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物 与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或 水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是 PCR 失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺 失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。 假阳性 出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增 保 龀龅腜 CR 产物为
5、非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。需重 新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污 染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸 入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消 毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本 前，反应管和试剂用 紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短， 但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻
6、或消除。 出现非特异性扩增带 PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与 非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物 聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR 循环次数 过多有关。 其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量 过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换 另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或 采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。 出现片状拖带或涂抹带 PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差， dNTP 浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少 酶量，或调换另一来源的酶。减少 dNTP 的浓度。适当降低 Mg2+浓 度。增加模板 量，减少循环次数。
