《蒜氨酸酶活的测定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蒜氨酸酶活的测定（1页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1. 粗酶液的制备粗酶液的制备250g 新鲜大蒜，加新鲜大蒜，加 300mL pH6.5 的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液 A (0.02mo1/LNaH2PO4和和0.02mo1/L Na2HPO4, 10% ( V/V)的甘油，的甘油，5% ( W/V ) NaCl)以最大速度均浆以最大速度均浆 1 min，四层纱布过滤，四层纱布过滤，10000 0g 冷冻离心冷冻离心 30min，得上清液。，得上清液。40%饱和度的硫酸饱和度的硫酸胺盐析，溶液缓慢搅拌胺盐析，溶液缓慢搅拌 20min 后，后，10000g 冷冻离心冷冻离心 30min，滤饼重新溶于，滤饼重新溶于70mL 磷酸缓冲液磷酸缓冲液 A
2、 中，得新鲜大蒜的蒜氨酸酶液。中，得新鲜大蒜的蒜氨酸酶液。 2. 酶活测定酶活测定 采用丙酮酸法测定采用丙酮酸法测定1。丙酮酸或丙酮酸盐能与丙酮酸或丙酮酸盐能与 2,4-二硝基苯肼反应生成二硝基苯肼反应生成 2,4-二硝墓苯肼丙酮酸盐，二硝墓苯肼丙酮酸盐，加碱处理后形成棕红色苯腙，加碱处理后形成棕红色苯腙，520nm 处有最大光吸收，这一反应也称羰基呈色处有最大光吸收，这一反应也称羰基呈色反应，并具有特异性。酶活力定义为在反应，并具有特异性。酶活力定义为在 25条件下，条件下，1mL 酶液酶液 5min 内反应产内反应产生生 1 nmol 丙酮酸所含的酶量为一个酶活单位丙酮酸所含的酶量为一个酶
3、活单位(unit )。标准曲线的制作：制备标准曲线的制作：制备 2mmo1/L 的丙酮酸钠，分别取丙酮酸钠溶液的丙酮酸钠，分别取丙酮酸钠溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL 于于 10mL 试管中，分别加入试管中，分别加入 0.1% ( mol/L/W)的的2,4-二硝基苯肼二硝基苯肼 0.5mL , 25保温保温 5min 后，再分别加入后，再分别加入 0.5mol/L 的的 NaOH 溶液溶液5mL，用去离子水补足到，用去离子水补足到 8mL , 25保温保温 10min 后于后于 520nm 处测吸光值，绘制处测吸光值，绘制标准曲线。标准曲线。第一种方法：标准反应体系第一种
4、方法：标准反应体系 1：0.1mol/L 的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液(pH6.5)含磷酸吡含磷酸吡哆醛哆醛 25 mol/L，蒜氨酸，蒜氨酸 10mmol/L。取标准反应体系取标准反应体系 1mL 在在 25预保温预保温 5min，与蒜氨酸酶液，与蒜氨酸酶液 0.05mL 在此温在此温度下反应度下反应 5min(以秒表计以秒表计)，立即加入，立即加入 10% ( W/V)三氯乙酸三氯乙酸 1.5mI 终止反应，反终止反应，反应液与应液与 0.5mL 2,4-二硝基苯肼二硝基苯肼(100mg 2,4-二硝基苯肼溶于二硝基苯肼溶于 100mL 2mo1/L HCl)25保温保温 5min，加入，
5、加入 5mL 0.5mol/L 的的 NaOH , 25保温保温 10min 后于后于 520nm 下下比色，以钝化酶及底物，比色，以钝化酶及底物，2,4-二硝基苯肼，二硝基苯肼，NaOH 等反应体系为空白对照。等反应体系为空白对照。第二种方法：取第二种方法：取 1 mL 标准反应体系（标准反应体系（60 mmol/L NaH2PO4和和 Na2HPO4 缓冲液，缓冲液，pH6.5，25 mmol/L PLP，20 mmol/L 蒜氨酸）蒜氨酸） ，于，于 25 条件下保温条件下保温 5 min， 加入加入 0.05 mL 蒜氨酸酶液，蒜氨酸酶液，25 条件下反应条件下反应 5 min，立即加
6、入，立即加入 1.5mL 10%三氯乙酸终止反应，再加入三氯乙酸终止反应，再加入 0.5 mL 的的 2，4-二硝基苯肼溶液，二硝基苯肼溶液，25 条件下保温条件下保温 5 min， 之后加入之后加入 5 mL 0.5 mol/LNaOH 溶液，溶液，25 条件下条件下保温保温 10 min， 于波长于波长 520nm 处测吸光值。处测吸光值。 以钝化酶为空白对照。以钝化酶为空白对照。1 Nock Linda P, Mazelis Mendel. The C-S lyases of higher plants: prepatation and properties of homogeneous alliin lyase from garlic (Album sativum)J. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1986, 249(1): 27-33.
