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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 与与 CA在肾细胞癌中的表达及临床意义在肾细胞癌中的表达及临床意义作者：彭启宇，温儒民，薛松 作者单位：徐州医学院附属医院泌尿外科，江苏徐州 221002【摘要】 目的 探讨缺氧诱导因子-1(HIF-1)与碳酸酐酶 9(CA)在肾细胞癌中的表达及相互关系。方法 采用免疫组织化学 P-V 方法检测 54 例肾癌石蜡标本切片中 HIF-1 和 CA的表达，并探讨其与临床病理因素之间的关系。结果 HIF-1 在肾癌组织中表达阳性率为 55.6%(30/54)，其表达与不同临床分期、病理分级有关(P0.05);CA在肾癌组织中表达阳性率为 68.5%(37/5
2、4)，其表达与不同临床分期、病理分级及组织学类型无关(P0.05);HIF-1 和 CA在肾癌组织中的表达呈正相关(r=0.437，P=0.001)。结论 肾癌中 HIF-1 和 CA的高表达和高相关性提示了以缺氧诱导因子通路为基础的分子靶向治疗的可行性。【关键词】 肾细胞癌;缺氧诱导因子-1;碳酸酐酶 9The overexpression and clinical significance of hypoxia-inducible factor-1 alpha and carbonic anhydrase in renal cell carcinomaPENG Qiyu, WEN Rumi
3、n, XUE SongDepartment of Urology， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou， Jiangsu 221002， ChinaAbstract: Objective To investigate the expression of HIF-1 KKME-专业医学搜索引擎 http:/ CA in renal cell carcinoma (RCC) and to evaluate their significance. Methods The expressions of HIF-1 and CA w
4、ere tested by immunohistochemistry in 54 specimens of RCC tissue, with the results analyzed by relating them to the clinical stage and pathological grade. Results The HIF-1 expression in RCC tissue was 55.6%, not related to the histological type (P0.05), but related to the clinical stage and patholo
5、gical grade of RCC (P0.05). The expression of HIF-1 was positively correlated with the expression of CA (r=0.437, P=0.001). Conclusion The overexpression and high correlation of HIF-1 and CA in renal cell carcinoma support the feasibility of using targeted molecular therapy to treat RCC.Key words: r
6、enal cell carcinoma (RCC); hypoxia-inducible factor-1 alpha; carbonic anhydrase 肾细胞癌(RCC)在成人泌尿生殖系统肿瘤中发病率仅次于膀胱癌居第二位，且对放化疗、生物治疗不敏感，预后较差。肾癌的发生机制复杂，约 60%的肾癌患者存在抑癌基因希佩尔-林道基因(VHL)的突变1，当 VHL 突变或失活后，VHL 蛋白缺乏，在氧含量正常的情况下，也无法降解缺氧诱导因子-1(HIF-1)，使 HIF-1 聚集导致下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)、碳酸酐酶 9(CA)、葡萄糖转运蛋白 1(GLUT-1)、促红细KKME
7、-专业医学搜索引擎 http:/ HIF-1 及下游靶基因产物 CA在肾癌组织中的表达，探讨其相关性及其与临床病理因素之间的关系。1 材料和方法1.1 标本来源收集 2004 年 1 月2006 年 6 月徐州医学院附属医院手术切除的肾癌石蜡包埋组织块 54 例，行苏木精-伊红染色确认符合诊断的标本行免疫组织化学研究。肾癌组织标本中：患者男性 31例，女性 23 例，年龄 1873 岁，平均(5312.5)岁;其中透明细胞癌 41 例，乳头状细胞癌 9 例，其他类型 4 例;按 1997 WHO 病理分级，G1 为 17 例，G2 为 23 例，G3-G4 为 14 例;按 TNM 分期(20
8、02 AJCC)，期 20 例，期 23 例，-期 11 例。12 例经病理证实的正常肾组织设为正常对照。1.2 主要试剂浓缩型一抗 HIF-1 鼠抗人单克隆抗体、通用型 P-V 试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)试剂盒为北京中杉金桥生物技术公司产品，浓缩型一抗 CA兔抗人单克隆抗体为美国 Santa Cruz 公司产品。1.3 实验方法全部标本经 10%甲醛固定，石蜡包埋，4 m 连续切片，免疫组化方法采用 P-V 二步法。石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2 室温孵育 5 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗， PBS KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 5 min，1 mmol/
9、L 乙二胺四乙酸(pH 8.0)抗原修复液行直接高压热修复并迅速冷却，分别滴加稀释的一抗(HIF-1 120，CA 1100)，4冰箱过夜。次日 37复温 25 min，PBS 冲冼，滴加二抗辅助液，室温或 37孵育 20 min，PBS 冲洗，滴加二抗，37孵育 30 min，PBS 冲洗。DAB 显色剂显色，自来水充分冲洗，复染，脱水透明，封片。用 PBS 代替一抗作阴性对照，已知乳腺癌阳性切片作阳性对照。1.4 免疫组化结果判定HIF-1 阳性表达定位于细胞核，极少表达于细胞质;CA阳性表达定位于细胞质，少量表达于细胞核及细胞膜。在 400 倍光镜下随机观察 10 个视野,每个视野计数
10、100 个细胞，观察阳性细胞个数并计算其平均数。HIF-1 阳性标准:阴性(-)为肿瘤组织完全不着色或阳性细胞数10%;阳性(+)为肿瘤组织阳性细胞数10%。CA阳性标准: 阴性(-)为肿瘤组织完全不着色或阳性细胞数10%;阳性(+)为肿瘤组织阳性细胞数10%。1.5 统计学处理应用 SPSS 13.0 软件进行数据处理;采用 Fisher 确切概率法分析 HIF-1、CA在肾癌的表达与病理分级、组织学类型及临床分期之间的统计学意义，采用 Spearman 等级相关方法分析 HIF-1 和 CA在肾癌的表达相关性;检验水准：= 0.05。2 结 果2.1 HIF-1 蛋白在肾癌组织中的表达KK
11、ME-专业医学搜索引擎 http:/ 在 54 例肾癌组织中的阳性表达率为 55.6%(30/54);不同病理分级间 HIF-1 阳性率有差别(P=0.015)，不同临床分期间HIF-1 阳性率有差别(P=0.04)，HIF-1 阳性表达率与肿瘤组织学类型无关(P=0.894)。见表 1、图 1。2.2 CA蛋白在肾癌组织中的表达CA蛋白在 54 例肾癌组织中的阳性表达率为 68.5%(37/54)，其表达与肾癌的临床分期、病理分级及组织学类型无关(P0.05)。见表 1、图 2。 表 1 肾癌组织 HIF-1 及 CA的表达及其与组织学类型、病理分级及临床分期的关系(略)2.3 肾癌组织中
12、HIF-1 与 CA蛋白表达的关系54 例肾癌组织中，有 26 例 HIF-1 蛋白与 CA 蛋白同时表达阳性，13 例两者同时表达阴性。HIF-1 蛋白与 CA 蛋白在肾癌组织中表达中呈正相关关系(r=0.437,P=0.001)，见表 2。表 2 HIF-1 与 CA 蛋白表达的相关性(略)3 讨 论HIF-1 介导转录的基因如 VEGF、CA、EPO、GLUT-1等2涉及血管新生、调节细胞内外微环境、铁与血红蛋白的代谢及能量代谢和 NO 的合成等，在肿瘤适应缺氧的过程中起着关键性的调控作用3，并在促进肿瘤的恶性转化、肿瘤的生长浸润和扩散以及对放疗及化疗抵抗中起着重要作用4。Zhong 等
13、5对包括结肠癌、乳腺癌、胃癌、肾癌等 19 种恶性肿瘤进行研究，其中有 13 种癌组织出现 HIF-1 过表达，大多数正常组织不表达或仅有少量表达。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 在正常肾组织无阳性表达，而在 54 例肾癌组织中阳性表达率 55.6%，提示多数肾癌组织缺氧导致 HIF-1 过表达，激活多种靶基因的转录，使之适应缺氧环境。CA 是由酸性氨基酸组成的跨膜糖蛋白，CA 能够催化 CO2 水化生成 H+和 HCO-3，HCO-3 与细胞内 Cl-交换,维持细胞内碱性环境，有利于细胞的生长;细胞内 H+则通过离子泵、H+-Na+交换等方式运输到细胞外,使细胞外为酸性微环境，细胞
14、外酸性环境可以激活细胞表面蛋白，在调控细胞增殖、转化方面有重要作用，并有利于肿瘤的生长和转移6。CA 位于 VHL 肿瘤抑制基因的下游，由 HIF-1 途径激活,在正常组织中表达极低,在肾细胞癌中高度表达。本实验显示，CA 肾癌表达率为 68.5%(37/54)，与肿瘤的病理细胞类型、病理分级、临床分期无明显相关性。本组结果显示，HIF-1 与 CA在肾癌组织中表达呈正相关关系(r=0.437，P=0.001)。HIF-1 与 CA 在正常组织中表达极低，在肾细胞癌中高表达，且肾癌对放化疗不敏感，免疫治疗有效率30%7，提示 HIF-1 与 CA 可能成为判断肾癌转移与预后等生物学行为的重要参
15、考指标并成为抗肿瘤治疗的新靶点。通过针对HIF-1 的治疗，抑制下游靶基因的表达，直接影响肿瘤的能量代谢及血管生成，有望取得满意的临床疗效。【参考文献】1Wiesener MS, M?nchenhagen PM, Berger I, et al. Constitutive activation of hypoxia-inducible genes related to KKME-专业医学搜索引擎 http:/ of hypoxia-inducible factor-1 alpha in clear cell renal carcinoma J. Cancer Res, 2001,61(13):5215-5222.2Semenza GL. Targeting HIF-1 for cancer therapy J. Nat Rev Cancer, 2003,3(10):721-732.3Kuijper A, van der Groep P, van der Wall E, et al. Expressi
