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1、 甲基对硫磷降解菌的分离鉴定及水解酶基因克隆表达摘要4-5Abstract5 1. 引言9-181.1 农药与环境污染91.2 有机磷农药的使用现状及中毒机理9-101.3 微生物降解有机磷农药的研究进展10-171.3.1 降解有机磷农药的微生物种类及筛选10-121.3.2 微生物降解有机磷农药的降解机理与代谢途径12-131.3.3 影响农药降解的因素13-141.3.4 有机磷农药降解酶基因的克隆14-151.3.5 降解酶的特性研究及工程菌的构建15-171.4 本文研究的目的和意义17-18 2. 实验材料与方法18-282.1 实验材料18-202.1.1 菌株和质粒182.1.
2、2 药品和试剂182.1.3 主要仪器和设备18-192.1.4 培养基与试剂配制192.1.5 常用缓冲液19-202.2 实验方法20-282.2.1 菌株的富集培养及分离纯化202.2.2 形态观察和生理生化鉴定202.2.3 基因组 DNA 的提取20-212.2.4 细菌 16S rDNA 的 PCR 扩增212.2.5 菌株 HS-D36 对甲基对硫磷的降解特性研究21-232.2.6 菌株 HS-D36 反硝化能力的测定23-242.2.7 DNA 片段的连接转化242.2.8 细菌质粒的提取242.2.9 DNA 限制性内切酶消化24-252.2.10 DNA 片段的回收252
3、.2.11 甲基对硫磷水解酶基因(mpd)的克隆252.2.12 原核细胞中重组质粒的筛选25-262.2.13 MPD 蛋白的原核表达及表达产物的 SDS-PAGE 分析262.2.14 重组甲基对硫磷水解酶 MPD 的初步研究26-28 3. 实验结果28-433.1 甲基对硫磷菌株的分离和鉴定283.2 形态观察及生理生化鉴定28-303.2.1 降解菌形态观察28-293.2.2 降解菌的生理生化鉴定29-303.2.3 菌株的生长曲线的测定303.3 降解菌 16S rDNA 的鉴定30-323.3.1 降解菌基因组 DNA 的提取30-313.3.2 降解菌的 16S rDNA 的
4、测序31-323.3.3 降解菌的系统进化分析323.4 菌株降解性能分析32-373.4.1 菌株 HS-D36 降解性能分析32-363.4.2 菌株 HS-D36 反硝化能力的研究36-373.5 甲基对硫磷水解酶基因 mpd 克隆表达37-413.5.1 PCR 扩增甲基对硫磷水解酶基因 mpd373.5.2 重组质粒 pMD-mpd 的构建及鉴定37-393.5.3 重组表达质粒 pET-mpd 的构建及鉴定39-403.5.4 mpd 基因在大肠杆菌 BL21 中的表达与鉴定40-413.6 粗酶液活性的初步分析41-433.6.1 对硝基苯酚标准曲线和蛋白质标准曲线的制作413.6.2 酶反应的最适温度、pH41-423.6.3 金属离子对重组酶粗酶液的影响42-43 4 讨论43-454.1 野生型菌株与重组工程菌434.2 降解途径的分析43-444.3 降解基因的克隆表达444.4 后续工作设想44-45 5 结论45-46 附录46-47 参考文献47-55 硕士期间发表的论文55-56 致谢56
