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1、1维生素 C 对病毒灭活中血浆蛋白活性的 保护效应作者：李燕，李明远，蒋仁举，贾文祥【摘要】 本研究探测在亚甲蓝（methylene blue，MB）光化学法处理单份血浆过程中，加入维生素 C （vitamine C，Vit C）是否影响病毒的灭活效果，是否对血浆蛋白活性成分具有保护作用。用水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）作为指示病毒，在人血浆中加入不同浓度 Vit C 和终浓度为 1 mol/L 的亚甲蓝，应用 40 000 lx 荧光强度照射并于不同时间取样检测。以细胞病变效应评价对 VSV 的灭活效果，用 RT-PCR 检测病毒核酸的变化，并
2、采用 Clauss 法一期法和微量免疫电泳等方法对亚甲蓝光化学法处理前后的血浆蛋白含量和活性进行分析。结果发现，VSV 血浆在加入 240 mol/L Vit C 并经 MB-光照 60 分钟后，病毒滴度下降8 lgTCID50/ml； RT-PCR 法也检测不到病毒核酸；血浆中的纤维蛋白原和凝血因子的回收率分别为 83.55%和 81.67%，与不加 Vit C 进行亚甲蓝光化学法处理结果相比有显著提高（P0.05）；微量免疫电泳显示，血浆中的大部分蛋白成分含量没有明显改变，免疫原性也未受到明显影响。结论：血浆中加入一定量的 Vit C 不仅不影响亚甲蓝光化学法对病毒的灭活效果，而且有效地保
3、护了血浆蛋白活性成分，因此 Vit C 可作为亚甲蓝光化学法处理血浆时的保护剂，能有效地提高单份新鲜冷冻血浆的质量。 【关键词】 病毒灭活Protective Effect of Vitamin C on Protien Activity in Plasma 2during Virus InactivationAbstract To determine whether addition of vitamin C (Vit C) to single-unit plasma could influence the efficacy of inactivating viruses and could
4、 maintain the activity of plasma proteins by methylene blue （MB）-light treatment.Vesicular stomatitis virus (VSV) Indiana strain was used as the indicating virus.Human plasma containing VSV was added with different concentrations of Vit C and final concentration 1 mol/L MB and irradiated by fluoresc
5、ence at an intensity of 40 000 lx，samples were collected at different times for detection.Cytopathic effect was used to test the effect of virus inactivation.A segment of the nucleic acid encoding capsid protein of VSV was amplified with RT-PCR.Some methods，such as the Clauss method，the one-stage me
6、thod，microimmunoelectrophoresis，were used to investigate the changes of plasma components.The results showed that when the VSV plasma was added with 240 mol/L Vit C and treated by MB-light irradiation for 60 min，the titer of VSV decreased by more than 8 lg TICD50/ml.Meanwhile，target segment amplific
7、ation of VSV was also negative.The recovery rates of fibrinogen and coagulation factor (F:C ) were 83.55% and 81.67% respectively，which had significant difference comparing with the routine MB-fluorescent light treatment. Most of plasma proteins were not affected significantly.No change in immunogen
8、icity of these proteins was observed by using microimmunoelectrophoresis. It is concluded that virus inactivation is not influenced and plasma proteins are effectively protected by Vit C. Vit C can be used as a protector and is beneficial to improving the quality of plasma subjected to MB-photodynam
9、ic treatment.Key words vitamin C; methylene blue-light treatment; virus inactivation; plasma protein为预防输注血浆引起的 HBVHCV 和 HIV 等病毒感染，现已研究出多种血浆病毒灭活方法，如有机溶剂加表面活性剂法-丙内酯加紫外线灭活法等，虽然这些方法已较为成熟，但后处理复杂，必须通过昂贵的色谱柱除去血浆中残留的有机物1。到目前为止，对临床单份新鲜冷冻血浆（fresh-frozen plasma，FFP）中病毒灭活的常用方法是亚甲蓝光化学法methylene blue（MB）-light tr
10、eatment，它在欧洲国家中应用较为普遍2。该方法不但对经血液传播的脂包膜病毒具有灭活作用，而且对一些非脂包膜病毒如猿猴病毒 40(Simian virus 40，SV40)、腺病毒也有灭活作3用3。Mohr 等4通过 PCR 技术检测到该方法对人类细小病毒 B19 的核酸也有损伤作用。亚甲蓝光化学法在对病毒灭活的同时，也会对血浆蛋白的活性成分造成损伤，从而影响血浆的临床适用范围及应用效果，尤其是血浆中的凝血类因子如纤维蛋白原(fibrinogen，Fg )和凝血因子 (coagulation factor，F )损失很大，高达 25%-35%5，6。如何在灭活病毒的同时提高血浆的质量呢？因
11、此必须寻找一种既不影响病毒灭活，又能在一定程度上保护血浆蛋白活性成分的保护剂。由于 MB 在光照条件下产生自由基从而灭活病毒，同时，也损坏血浆蛋白。因此，利用生物抗氧化剂如维生素 C（Vitamin C，Vit C)、-生育酚、-类胡萝卜素、还原型谷胱甘肽等都可以清除体内产生的氧自由基，切断过氧化链反应。王海华等7 发现，Vit C 清除羟自由基（OH）的能力最强。Jaakko 等8 也认为，在 MB 光化学法中，部分凝血因子损伤与 Vit C 浓度成负相关。因此，本研究选择在血浆中加入一定量的 Vit C，观察 MB 光化学法对血浆中 VSV（vesicular stomatitis vir
12、us，VSA）病毒的灭活效果及对血浆蛋白活性成分的影响。VSA 病毒是一种具有脂包膜的 RNA病毒。材料和方法材料单份新鲜冷冻人血浆 （成都生物制品研究所）； 亚甲蓝（Sigma 公司产品）；维生素 C（Roche 公司产品）；RevertAidTM first strand cDNA Synthesis Kit（北京晶美生物工程有限公司产品）；兔抗人血清（北京邦泰生物技术有限公司产品）；电子式紧凑型荧光灯（中山市欧朗光国际照明有限公司产品）；JD-3 型数字式照度计(上海市嘉定学联仪表厂产品)。4方法VSV 培养和病毒效价测定VSV 和非洲绿猴肾细胞 （Vero） 细胞均为本室保存的细胞。V
13、SV 用 Vero 细胞培养传 3 代，收集培养上清液，用 10 倍连续稀释法稀释，加入培养有 Vero 细胞的 96 孔板中，每稀释度分别接种 4 孔，5% CO2 孵箱中培养 3-4 天，在倒置显微镜下观察细胞病变 （cytopathic effect，CPE），按 Karber 法计算病毒滴度。当 VSV滴度8 lgTCID50/ml，置-20短时保存备用。MB 光化学处理含 Vit C 的血浆通过小量实验（5.0 ml）观察 MB/光化学法灭活 VSV 的效果。单份冷冻人血浆在 27下水浴融解，分装至培养管，每管 5.0 ml，加入 0.5 ml VSV，再加入0、240、480 mo
14、l/L Vit C 和终浓度为 1 mol/L MB。在 4-6条件下充分混匀 1 小时，在 25条件下经 40 000 lx 荧光强度照射，分别在 015304560 分钟取样 100 l。用 Karber 法测定样品中病毒滴度。将此实验确定的最适 Vit C 浓度和最适光照时间用于后述研究。RT-PCR 分析病毒核酸取 MB 光化学法处理的血浆 100 l，加入 1 ml TRIZOL 试剂，按常规方法提取血浆总 RNA，用 RT-PCR 分析病毒核酸。RT 反应按试剂盒说明操作，反转录出的 cDNA 直接用于 PCR 扩增。根据 GenBank 号为 J02428 的 VSV-India
15、na 株全基因组资料，选择其核衣壳基因为扩增靶序列，用 Primer Primier 5 软件随机设计若干对候选引物，再根据引物设计原则进行筛选比较，从中选出一对引物： P1 5-5ACG GCG TAC TTC CAG ATG G-3；P2 5-CTC GGT TCA AGA TCC AGG T-3 。由上海博亚生物技术有限公司合成。该对引物分别位于编码 VSV 核衣壳蛋白基因的 404-422 位和 802-820 位，扩增出的目的片段长度为 417 bp。PCR 反应条件为：94变性 45 秒，55退火 60 秒，72延伸 60 秒，共 31 个循环。最后在 72下延伸 5 分钟。该实验
16、用正常血浆（FFB 组）作为阴性对照，含 VSV 未行病毒灭活处理的血浆为阳性对照，实验组是用 MB 光化学处理含 240 mol/L Vit C 的 VSV血浆（FFB+Vit C+MB 组），分别于光照 15、30、45 和 60 分钟取样检测。血浆生化指标和生物学性质测定用全自动生化分析仪测定不同处理组血浆中的总蛋白、白蛋白、葡萄糖、乳酸脱氢酶和胆固醇等生化指标；用 Clauss 法测定纤维蛋白原含量，用一期法测定凝血因子活性，每样品平行测定 3 次。该实验重复 3 次。以正常血浆为对照样品。血浆蛋白微量免疫电泳分析用巴比妥缓冲液配制 1% (g/ml) 琼脂凝胶，均匀铺板(10 cm7.5 cm)。在距琼脂板端 2 cm 处平均间距打直径为 3 mm 的孔(共 3 孔)。并分别加入 10 l 实验样品和对照样品，以 5 V/cm 端电压电泳 2 小时。然后在板中 2 孔之间打 1 个 5 cm长、3 mm 宽的槽，加入兔抗
