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1、1低氧对间充质干细胞的影响【摘要】 氧对于几乎所有的生命都是必需的，它维持能量代谢及细胞的功能，但机体多种细胞是处于生理或病理性低氧状态中，而体外细胞实验一般是在 20氧浓度下进行，并不符合生理状态。直到最近，关于低氧对于间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）的影响有了一系列的研究。体外实验表明，适度低氧下 MSC 的生长和存活能力更好，氧浓度可以影响 MSC 向成骨、成软骨、成脂的分化倾向，低氧能提高特异性受体和配体相结合所介导的迁移。低氧可影响胚胎干细胞、造血干细胞、神经干细胞的生理学特性也是一证据。干细胞对缺氧反应的分子机制主要涉及低氧诱导因子 1 (hy
2、poxic inducible factor 1，HIF 1)信号通路。本文综述了低氧对 MSC 的存活、增殖、分化和迁移的影响，以及涉及 HIF 1等的分子机制。 【关键词】 低氧；间充质干细胞；细胞增殖； 细胞分化； 细胞迁移Effect of Hypoxia on Mesenchymal Stem Cells ReviewAbstract Oxygen is issential for life，but cultivation of cells is usually performed under 20O2 , that do not replicate normal physiolog
3、ical hypoxia or pathological hypoxia conditions in the body. Recently, the effect of hypoxia on mesenchymal stem cells (MSCs) has been studied, under physiological hypoxia, MSCs thrive well, and the ability differentianing to osteoblast, chondrocyte and adipocyte as well as the ability of migration
4、are changed. Hypoxia changes the physiological characteristics of embryonic stem cell, hematopoietic stem cell and neuron stem cell as well. The mechanism of these responses might be primarily involved in the hypoxic inducible factor 1 (HIF 1) signal pathway. This review emphasizes that hypoxia is a
5、n important factor on all major aspects of stem cell biology including survival, proliferation, differentiation, and migration, and the mechanism involved in HIF 1 signaling pathway behind these responses was also discussed.Key words hypoxia; mesenchymal stem cell; cell proliferation; cell different
6、iation; cell migration2间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）具有强大的自我更新及多系分化潜能，体内移植后可以迁移至损伤的部位（多数为缺血缺氧的环境）修复相应的组织。干细胞体外增殖分化的研究通常是在 20O2 的条件下，然而体内氧浓度显著低于此值，动脉血氧浓度约为 12%，组织的平均氧浓度约为 3%, MSC 的主要积聚部位 骨髓的氧浓度为 1%-7%, 富集干细胞的胚体氧浓度更低，而且处于一种动态变化之中。通常所谓的低氧更符合生理状态，过高浓度的氧对细胞反而具有损伤应激作用。除生理性低氧外，机体经常会有病理性低氧的发生，如心肌梗塞，脑卒中等
7、，这时相应的组织细胞处于缺血缺氧的状态中，尽管缺血的组织氧和营养都不足，但缺氧可单独影响细胞的生理学特性。那么在低氧下，MSC 的存活、增殖、分化，以及迁移能力有什么样的变化呢？低氧对间充质干细胞凋亡和存活的影响干细胞移植研究是一大热点，但移植到缺血的部位后不是所有细胞都可以存活。实验证明，适度的低氧并不引发 MSC 凋亡。虽然 Geng1将 MSC 注射到发生心肌梗塞 SCID 小鼠的心室，4 天后 99%的 MSC 死亡；Zhu 等2将 MSC 置于低氧（3O2）及无血清的条件下（模拟缺血环境）培养， 细胞中 caspase 3(半胱天冬蛋白酶 3)活性增高，发生依赖 caspase 的凋
8、亡，但单独的低氧条件不能增高caspase 3 活性，诱导凋亡的效应不明显，只是能提高无血清诱导的凋亡效率。此研究结果表明，MSC 对缺血缺氧的环境敏感，但导致其凋亡的主要因素不为低氧。Follmar 等3发现,在 0.1% O2（极度低氧）下兔来源的干细胞死亡增多，但他们同时证明在有限的氧浓度下干细胞依旧可以存活。 Greijer 等4的实验表明,缺氧的严重程度决定着细胞凋亡或者适应缺氧而存活， 0.5 O2 可以启动细胞的凋亡，从而阻止低氧诱导突变的积累，在此过程中存在着复杂诱导凋亡和抗凋亡间的平3衡，涉及低氧诱导因子 1（hypoxic inducible foctor 1, HIF 1
9、）与多种因子的结合，如胚胎干细胞在 0.5% O2 的条件下，HIF 1 诱导 VEGF 表达升高，若抑制 VEGF的表达，细胞凋亡数增加 10 倍5。用适当的基因修饰后，MSC 对缺血缺氧的耐受力提高。缺血的组织中缺氧/再灌注、炎性因子、诱导凋亡因子等是导致细胞死亡的因素，而 HO 1（血红素加氧酶）是抑制这些因子的关键成分。将转染 HO 1基因的 MSC 及对照组细胞移植入发生急性心肌梗塞的小鼠心脏，7 天后实验组的移植细胞存活率比对照组高 3 倍6。而 Akt1（蛋白激酶 B）修饰的 MSC 也能更好的存活于缺血缺氧的环境，可有效抑制大鼠缺血心肌的重塑，完全纠正心脏的舒缩功能，修复的心容
10、量比未用 Akt1 修饰的 MSC 所修复的高 4 倍7。中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(2)低氧对间充质干细胞的影响低氧对间充质干细胞增殖和原始状态的影响 MSC 主要来源于骨髓，骨髓是一典型的低氧环境。体外实验证实，低氧可抑制 MSC 分化而有利于增殖。DIppolito 等8将骨髓来源的多能成体干细胞于 3%氧浓度下培养 3 天后，数目比 21%氧浓度下培养 7 天多 3 倍。Grayson9将人来源的 MSC 于 2% O2 条件下在三维支架中培养 1 个月，与 20% O2 相比，低氧下的 MSC 有一延长的停滞期来适应培养条件，然而在随后的培养期间
11、一直处于增殖状态，产生集落形成单位的能力显著增高，且干细胞标志性基因表达水平更高。Bosch 等10 分离培养猪来源的 MSC，同样发现其在低氧条件下增殖能力增强。低氧可维持关键性干/祖细胞因子 pref 1（前脂肪细胞因子）的表达11。另有实验表明，低氧培养条件下 MIAMI (marrow isolated adult multilineage inducible) 细4胞 OCT 4、REX 1、 SSEA 4（胚胎阶段特异性抗原 4）mRNA 的表达比常氧下高，端粒逆转录酶的活性增加，即使在成骨诱导条件下，低氧使成骨标志性基因的表达受到抑制，而干细胞标记物的表达没有改变8。Lennon
12、 等12将培养的原代或者第一代大鼠 MSC 移植入同基因受体鼠，与常氧下培养相比，低氧下培养的细胞在体内表现出更强的成骨能力；Xie 等13证实，MSC 经低氧预处理后更易向心肌样细胞分化。这些研究者推测，低氧是保持干/祖细胞未分化状态的重要因素，可促进这类细胞增殖而保持多能性，MSC 在低氧的环境中能维持自我更新的能力，而接近血管处于高氧环境时，才倾向于分化。另一方面，标准的培养技术最初用来培养纤维母细胞，而对其他细胞有应激损伤作用。MSC 在体内处于低氧环境中，因而对高氧应激敏感，在 21%氧浓度下培养的细胞比 5% 氧浓度下培养的细胞产生更多的氧化产物，对生长不利14。由此认为，用于移植
13、的 MSC 适于在合适的低氧环境中扩增。低氧对间充质干细胞分化的影响大量的研究表明，氧浓度可以调节成软骨的发育、神经干细胞的分化、胎盘滋养层等的分化15-19。同样，低氧对 MSC 的分化有着深刻的影响。低氧对间充质干细胞向软骨分化的影响体内软骨也是处于一种氧浓度低于平均水平的环境，关于低氧对 MSC 向软骨分化的作用，目前体外实验的报道结果并不一致。Wang 等20将人 MSC 置于 5%和 20% O2 浓度下向成软骨诱导，低氧下细胞分泌大量软骨相关的基质分子，包括 II 型胶原和硫酸软骨素，胶原合成率比常氧下高 3 倍。此结果表明，MSC 在形成软骨过程中，氧浓度对其代谢具有重要的调节作
14、用，在软骨组织工程中，外源性5氧浓度的控制可影响基质分子的沉积。但 Malladi 等21在体外用三维培养模型添加诱导因子以诱导 MSC 向软骨分化，结果发现置于 2% O2 比置于 21% O2 下向软骨分化率低。这种不一致结果的报道，可能是因为不同的实验室使用的细胞以及培养条件有所差异。低氧对间充质干细胞成骨分化的影响将可多系诱导的成体干细胞向成骨诱导，21%氧浓度条件下成骨细胞标志性基因骨钙蛋白（osteocalcin）、骨涎蛋白（bone sialoprotein, BSP）、osterix、Runx2 及碱性磷酸酶（ALP）的表达或活性上调，然而在 3% O2 条件下这些基因及蛋白的
15、上调被阻滞，而干细胞标记物的表达却没有改变; 同样，在成骨诱导条件下长期培养时21% O2 浓度下矿物质沉积很明显，但在低氧下 (3% O2)矿物质几乎检测不到，其他一些研究者得到一致的结果8，21，22。这些研究者推测，在体外低氧更接近生理状态，有利于 MSC 的增殖而抑制分化。低氧对间充质干细胞成脂分化的影响Lee 等23将 MSC 培养于 2% O2 条件下，与 19.5 O2 的条件相比较，MSC 向脂肪细胞分化能力降低。Yun 等19使用 3T3 L1 脂肪前体细胞研究发现，在0.01和 2 O2 条件下， HIF 1 上调 DEC1/Stra13 的表达，从而抑制调节脂肪生成的主要
16、基因过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor 2，PPAR 2）启动子的激活，导致了成熟脂肪细胞形成受阻。Fink 等24发现了一个有意思的现象是，不加诱导因子条件下将人 MSC 置于 1% O2 下培养，24 小时即可见脂滴的形成，相比较 20% O2 浓度下加诱导剂，脂滴小而分布均匀；而氧浓度高于 2%时，72 小时也未见脂滴出现。但在 1% O2 下， 过氧化6物酶体增殖物激活受体 2 和 脂肪细胞定向和分化因子/类固醇调节元件结合蛋白 1c（adipocyte determination and differantiation factord/sterol regulatory element binding protein 1c, ADD1/SREBPK）并没有受到诱导，而且也未影响早期和晚期标志性基因 脂蛋白脂酶（LPL）和 aP2 的转录，同样，检测不到成熟脂
