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1、1大鼠急性肾缺血再灌注对细胞内钙水平 与细胞凋亡的影响【摘要】 目的：观察缺血再灌注损伤对肾细胞游离钙（Ca2+i）水平和细胞凋亡的影响。方法：采用摘除大鼠左肾，钳夹右侧肾蒂的方法，建立急性缺血再灌注肾损伤模型，应用 Fura-2/AM 荧光指示剂测定缺血再灌注大鼠肾细胞Ca2+i 水平，流式细胞术检测肾细胞凋亡率。结果：缺血再灌注不同时期肾细胞呈现不同程度 Ca2+ 超载，与对照组相比差异显著（P 0.01）；肾细胞凋亡率与对照组相比差异显著（P 0.05）。结论：缺血再灌注不同时期肾细胞呈现 Ca2+ 超载现象并与肾细胞凋亡率有正相关趋势，再灌注时间与肾细胞 Ca2+ 超载呈正相关，提示再
2、灌注损伤在加重细胞钙超载同时增加了肾组织细胞凋亡，可能是再灌注损伤肾功能障碍的重要原因。 【关键词】 缺血再灌注；肾组织；细胞钙超载；细胞凋亡Abstract Objective To study the effect of renal ischemic reperfusion injury on tracellular inonized calcium level and apoptosis. Methods The model of rats acute renal ischemic reperfusion injury was established. Renal intracellul
3、arCa2+i level was determined by Fura-2/AM fluorescence assay, and renal cell apoptosis was measured by flow cytometry. Results Compared with control group, renal intracellularCa2+i level increased significantly (P 0.01) and apoptosis rate increased significantly (P 0.05) at differentperiod of ischem
4、ic reperfusion. Conclusion At different period of rats acute renal ischemic reperfusion injury,renal intracellularCa2+i overloading and the rate of apoptosis were relevant. Reperfusion time and renal intracellularCa2+i overloading were relevant, which suggested that the reperfusion injury might aggr
5、egate overload of intracellularCa2+i by different mechanisms.肾缺血再灌注损伤综合征是公认的移植肾重要的致病因子，不但与移植肾功能延迟恢复的发生密切相关，而且也与肾移植术后急性和慢性排斥反应的发生和进展密切相关1。肾缺血再灌注损伤的发生机制，涉及诸多因素，其中细胞内钙代2谢紊乱占有相当重要的位置，可能与急性缺血缺氧造成细胞内信号传导障碍及细胞膜性结构改变有关。另外，急性缺血缺氧会引起细胞的急慢性损伤、死亡和细胞凋亡。细胞内游离钙（Ca2+）是介导细胞生理与病理作用的重要信使，其浓度异常升高会引起细胞的急慢性损伤和死亡，还可引起组织细胞
6、的氧化侵袭。因此，本实验拟就缺血再灌注不同时期肾细胞内钙含量（Ca2+i）和肾细胞凋亡水平进行研究，为探讨缺血再灌注损伤的发生机制提供实验依据。1 材料与方法1.1 实验动物及主要试剂1.1.1 动物分组 实验动物系白求恩医科大学实验动物部提供，为封闭群动物。取雄性（避免雌激素对缺血的调节作用）Wistar 大鼠 30 只，体重 200250 g。随机分为假手术对照组（组）、缺血 1 h 组（组）、再灌注 1 h 组（组）、再灌注 2 h 组（组）和再灌注 24 h 组（组）。1.1.2 试剂 Fura-2/AM 购自 Calbiochem 公司。1.2 实验方法1.2.1 手术方法及取材 将
7、 Wistar 大鼠在 20% 乌拉坦（按 1 gkg-1，iv）麻醉下进行手术。腹中线切口，左肾静脉穿刺取血，摘除左肾，以避免健侧的代偿作用。组：单纯切除左肾，分离右肾动脉、静脉，不夹闭右肾动静脉，作为假手术对照组；组：夹闭右肾动静脉 1 h，取右肾作为再灌注损伤阴性对照组。夹闭肾动静脉 1 h 去除动静脉夹， 静脉补给生理盐水 20 mL。恢复血流再灌注 1 h（组）；2 h（组）和 24 h（组）取右肾，同时留取血液做肾功能检测。肾上极组织做光镜3和电镜检查，其余肾组织按实验要求处理。1.2.2 肾细胞游离钙浓度（Ca2+i）测定 用荧光标记探针 Fura-2/AM 标记 Ca2+，荧光
8、分光光度仪（日本，F4010 型）检测2。1.2.3 细胞凋亡检测 细胞凋亡率检测采用流式细胞仪（美国 Coulter 公司 ILIT -型）检测。1.3 统计学方法全部实验数据采用 SPSS 8.0 统计软件，统计数据用 xs 表示，组间分析采用方差分析和 q 检验。相关分析采用直线相关分析法。2 结 果2.1 缺血再灌注肾组织病理改变肉眼观肾组织在急性缺血及再灌注后肾皮髓质微白并有轻度肿胀，余未见明显大体改变。光镜下病理改变：急性缺血及再灌注 1 h 组即可见肾小管上皮细胞发生肿胀、变性；再灌注 2 h 和 24 h 组见肾小管上皮细胞肿胀加剧，小管腔变窄，并出现上皮细胞坏死，肾小球基底膜
9、增厚。电镜结果：急性缺血再灌注肾组织出现系列损伤性变化，近曲肾小管发生变性、小管腔表面微绒毛减少或消失、甚至发生溶解坏死；内质网脱颗粒扩张呈空泡状、线粒体肿胀畸形、嵴断裂（图 1）；膜性细胞器发生髓样变性；微血管腔明显缩小或内皮细胞溶解；肾小球 3 层膜明显增厚，足突融合或消失等改变（图 2）。对照组肾组织细胞超微结构未见异常改变。42.2 缺血再灌注后肾功能的改变急性缺血再灌注损伤后肾脏功能有不同程度改变，本项实验以血清 Cr 和 BUN 水平作为评价肾功能的检测指标。在急性缺血和再灌注早期（再灌注 12 h），肾损伤改变明显，与对照组相比血清 Cr 和 BUN 明显增高（P 0.01），再
10、灌注晚期（24 h）,肾功能未见明显改善，与对照组相比损伤仍很明显（t = 3.32，P 0.05），见表 1。2.3 急性缺血及再灌注对肾细胞（Ca2+i）的影响应用荧光分光光度仪检测急性缺血及再灌注损伤肾细胞（Ca2+i）均明显增高（t = 3.4897.74，P 0.01），尤以再灌注 24 h 组最为显著（t = 13.21，P 0.01，表 2）。 2.4 肾组织细胞凋亡水平流式细胞仪检测细胞凋亡率（表 3），在再灌注各组均可见明显的凋亡峰，表明再灌注损伤直接造成以细胞凋亡为主的细胞 DNA 分子的损伤性改变。2.5 肾细胞（Ca2+i）与肾细胞凋亡率相关性相关分析显示缺血再灌注细胞
11、 Ca2+ 超载与肾细胞凋亡率有正相关趋势。表明在急性肾缺血再灌注损伤中，肾细胞 Ca2+ 超载可能加重和/或诱导了细胞凋亡的发生。2.6 肾损伤程度与细胞凋亡相关性本研究中细胞凋亡率与肾功能损伤正相关（r = 0.69），揭示缺血再灌注损伤中肾5功能难以恢复与细胞凋亡过多有关。3 讨 论缺血再灌注损伤存在复杂的生物信息调节机制，其中肾组织细胞内钙代谢失衡和细胞凋亡关系密切并与再灌注病理损伤密切相关。肾缺血缺氧时血管紧张素、内皮素等缩血管物质生成释放增多，使肾血管收缩，致再灌流时产生无复流现象。本研究显示，在急性缺血和再灌注不同时期均有肾组织微结构改变，并伴随肾功能严重受损。缺血缺氧本身即可引
12、起组织细胞钙代谢失衡，加之细胞膜结构的破坏，导致细胞膜各种泵功能受损等一系列改变，造成细胞内严重的钙超载现象，细胞膜和细胞器膜性结构损伤，既是细胞 Ca2+ 超载的病理组织学基础，也可能是细胞 Ca2+ 超载的结果。研究证明缺血再灌注损伤存在细胞钙超载和细胞凋亡机制的参与3-5。Ca2+ 作为许多血管活性物质的第二信使，增加血管张力，降低肾血流量和肾小球滤过率。细胞（Ca2+i）升高，损伤血管内皮细胞，减少内皮源性血管扩张因子产生，进一步诱发和加剧血管收缩，促进病理损害。本项研究中缺血组和再灌注各不同时期细胞（Ca2+i）均明显增高，证明缺血及再灌注导致肾细胞内钙含量增高，其原因可能主要为：细
13、胞钙内流增多、向细胞外排出减少。再灌流早期（12 h），脂膜 Ca2+ - ATPase 活性有所恢复，细胞内钙与缺血期相比略有降低，表明钙外排增多，但仍高于正常对照组。再灌注晚期细胞和细胞器膜性结构损害加重，泵功能进一步降低和细胞内钙池（内脂网、线粒体等）Ca2+ 释放进入细胞浆，另外，组织液中的 Ca2+ 可通过细胞膜受损部位进入细胞内，而使细胞内（Ca2+i）进一步升高，进而加重肾损害。胞浆 Ca2+ 超载可引起细胞凋亡，凋亡中 DNA 降解片段现象与内源性 Ca2+/Mg2+ 依赖性核酸内切酶活性增高相一致6。缺血再灌注损伤可引起机体组织细胞 Ca2+ 超载，一方面与组织抗氧化6能力降
14、低和脂质过氧化物增多引起的细胞膜钙通道开放有关3，另一方面也诱导了组织细胞的凋亡。用钙拮抗剂或阻断钙通道，可以明显减弱细胞凋亡的超微结构改变、减轻细胞凋亡发生率、减轻缺血再灌注肾损伤，也证明了（Ca2+i）与缺血再灌注损伤时细胞凋亡的发生密切相关7，8。本研究从一个侧面反映了移植早期的病理损伤机制与肾组织细胞 Ca2+ 超载和细胞凋亡的发生有关。上述结果表明，缺血再灌注在肾损伤机制中存在钙代谢紊乱、细胞内 Ca2+ 超载和不同程度的肾细胞凋亡，提示再灌注损伤在细胞超微结构水平和信息转导系统中通过不同机制加重了细胞的钙超载和细胞凋亡。【参考文献】1Lario S, Mendes D, Besco
15、s M, et al. Expression of transforming growth factor- beta1 and hypoxia-inducible factor-1alpha in an experimental model of kidney transplantationJ. Transplantation, 2003, 75(10):1647-16542方福德, 周吕, 丁濂, 等. 现代医学实验技巧全书(下册)M. 北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1995. 220-2253Schumer M, Colombel MC, Sawchuk TS, et a
16、l. Morphologic, biochemical and molecular evidence of apoptosis during in the reperfusion phase after brief periods of renal ischemiaJ. Am J Phathol, 1992, 140(4):831-8344Zador Z, Lacza Z, Benyo Z, et al. Apoptosis in focal brain ischemiaJ. Ideggyogy Sz, 2003, 56(7-8):216-2285Anderson KM, Alrefai WA, Dudeja PK, et al. Increased cytosol Ca2+ and type 1 programmed cell death in Bcl-2-positive
