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1、1血管活性肠肽对暂时性脑缺血大鼠梗死 体积的影响作者：赵朝华 胡晓丹 杨杰 钱亦华 邱芬 刘勇 【摘要】 目的 通过活体实验研究血管活性肠肽(VIP)对脑缺血损伤的神经保护作用。方法 大鼠侧脑室内注射 VIP 后，采用大脑中动脉线栓(MCAO)法诱导建立暂时性局部脑缺血模型。通过神经学的评价对 MCAO 大鼠进行判定和筛选；TTC染色测定大鼠脑梗死体积；双抗夹心 ELISA 检测血清 S100 的含量。结果 MCAO 后 2h 大鼠呈现不同程度的神经功能损伤症状。评定为 1-2 级的仅有 2 例出现明显脑梗死区，3 级的为全部。VIP 注射后大鼠脑梗死体积明显缩小，较对照组减少约 25%(P0
2、.05)；血清 S100 浓度也明显降低(P0.05)。结论 以神经学评分 3 级作为 MCAO 模型成功的判定标准是较为可靠的。VIP 脑内注射可明显减小脑缺血后梗死体积，具有神经保护作用。VIP 可以降低 S100 的含量，这可能涉及到 VIP 的另一神经保护机制。 【关键词】 血管活性肠肽；脑缺血；梗死体积；S100Effects of vasoactive intestinal peptide on the infarct volume in rat transient focal cerebral IschemiaABSTRACT: Objective To explore the
3、neuroprotective effects of vasoactive intestinal peptide (VIP) on ischemic brain injury in vivo. Methods In the present study, VIP was given via intracerebroventriclar injection, and then focal cerebral ischemia was induced in SD rats by intraluminal occlusion of middle cerebral artery (MACO) for 12
4、0min. The evaluation and screening of rats with successful occlusion of MCA were performed by neurological testing. The infarct volume was investigated with 2, 3, 5 triphenyltetrazolium chloride (TTC) stain. S100 concentration in serum was detected by double antibodies sandwich ELISA method. Results
5、 The different 2grades of neurological severity appeared obviously in all the rats at 2 hours after MCAO. Only two rats that scored grade 1 or 2 had identifiable areas of infarction, whereas the areas of infarction in all the rats that were scored grade 3 were identified. Compared to the control gro
6、ups at 1 day, injection of VIP significantly reduced the relative infarct volume by approximately 25% (P0.05), and then remarkably decreased S100 serum concentration (P0.05). Conclusion The grade 3 of neurological score as a standard to evaluate successful occlusion of MCA is satisfactory and reliab
7、le. VIP injection can reduce the infarct volume in a rat model of focal cerebral ischemia. The present study provides further evidence for the neuroprotective effects of VIP in vivo. VIP may decrease S100 serum concentration, which may involve one of the mechanisms of the neuroprotective effect of V
8、IP.KEY WORDS: vasoactive intestinal peptide; cerebral ischemia; infarct volume; S100缺血性脑血管病具有高发病率、高死亡率、高致残率和高复发率的特点，是中老年人常见的脑血管疾病，引起国内外医学界特别是神经科学界的重视。急性的脑缺血损伤是非常复杂的病理生理过程，许多环节尚未阐明。目前，用于脑保护治疗的药物很多，但是有确切疗效的却寥寥无几。进一步深入了解脑缺血的机制，探究更为有效的治疗方法和药物已经成为医学界面临的重要问题。血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)由 28
9、个氨基酸残基组成。它与组异肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽、生长激素释放激素及促胰液素的结构相似，属于促胰液素 胰高血糖素 血管活性肠肽家族的成员。体外实验显示 VIP 能提高培养的星形胶质细胞(astrocyte, AS)摄取谷氨酸的能力，促进胶质源性营养物质的释放，参与保护神经元1。提示 VIP 在脑缺血损伤中可能具有神经保护作用，但缺乏足够的活体实验证据，具体作用及机制有待深入研究。因此，本实验通过活体研究观察脑内注射 VIP 后对暂时性局部脑缺血大鼠缺血体积和血清 S100 浓度变化的影响。1 材料与方法1.1 实验动物 健康雄性 Sprague Dawley(SD)大鼠由西安交通大学医学院
10、实3验动物中心提供，鼠龄 8-12 周，体重 240-280g。实验前常规环境分笼饲养至少3d。1.2 药物实施 大鼠经水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪，参照包新民等的大鼠立体定位图谱，选择右侧脑室以前囟(Bregma 点)为0 点，向后 1.0mm，旁开 1.4mm，深 3.5mm为注射区，VIP 组大鼠注射VIP(0.25g/L)溶液 2L，留针 10min，缝合皮肤。对照组大鼠用等容量生理盐水作同样处理。然后制作成暂时性局部脑缺血模型。1.3 暂时性局部脑缺血模型的建立 VIP 脑内注射后即刻参考 longa 等2描述的管腔内线栓技术闭塞右侧大脑中动脉(mi
11、ddle cerebral artery occlusion, MCAO)诱导建立暂时性局部脑缺血大鼠模型。简要手术过程：大鼠做颈部前正中切口，分离暴露右侧颈部血管，用微动脉夹暂时夹闭颈内动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉。将头端加热呈光滑椭圆球形的 3 0 单股尼龙线(宁波医用缝针厂)经颈外动脉缓慢插入颈内动脉至感到有轻微阻力为止，进线长约 18mm 左右。手术期间使用电热毯维持大鼠体温在 36.5-37.5之间。MCAO 后 2h 轻轻抽出尼龙线至颈外动脉结扎处。1.4 神经学的评价 大鼠 MCAO 后 2h 参照 Bederson 等3方法进行神经功能损伤程度的评定，即 0 级：行为正常；1
12、级：提尾悬空左侧前肢屈曲，肩内收；2 级：抵抗对侧推力下降，伴前肢屈曲；3 级：自发性侧向旋转或运动，伴抵抗对侧推力下降和前肢屈曲。评定为 3 级者被视为成功脑缺血模型。1.5 血清标本制备 动物于处死前，经右心室取血 1.510-3L，3000r/min 离心10min，吸取上清液，-20冻存。41.6 氯化三苯基四氮唑(TTC)染色 VIP 组(n=5)和对照组(n=5)大鼠于 MCAO后 24h 处死，断头迅速取脑，置于-20冷冻 10min 后，在脑片床上自前向后行2mm 厚连续冠状切片，将切片立即置于预热的 20g/L TTC(国药集团化学试剂有限公司的产品)溶液中，于 37恒温下避
13、光染色 30min，随后置于 40g/L 多聚甲醛溶液中固定 24h，照像。1.7 梗死体积测定 将 TTC 染色照片扫描并存储，使用 Motic Images Advanced 3.0 图像分析系统测定梗死体积。为消除水肿的影响，梗死体积以占缺血侧半球体积的百分比表示。即：梗死体积(%)(直接梗死体积同侧半球体积)100%。1.8 血清 S100 含量的测定 采用双抗夹心 ELISA 检测血清 S100 含量。按照 S 100 ELISA 试剂盒(由第四军医大学生理学教研室提供)说明进行。小鼠抗大鼠 S 100 单克隆和兔抗 S 100 多克隆抗体均由武汉 Boster 公司提供。1.9 统
14、计学分析 所有数据均以均数标准差表示，并定义 P0.05 为显著性界值。样本之间的显著性采用 t 检验方法处理。2 结果2.1 神经学的评价 各组大鼠的体重、体温没有明显不同。MCAO 后 30min 内每只大鼠的体温都有所增高，但此后便逐渐下降(恢复)到正常范围。所有动物苏醒后均出现右侧上眼睑下垂等 Horner 征。MCAO 后 2h 神经功能损伤程度的评定显示共有 7 只大鼠为 1 或 2 级，10 只为 3 级，各组间没有明显差异。24h 后经 TTC染色证实，评分为 1-2 级的大鼠仅有 2 只出现明显脑梗死区，而评分为 3 级的大鼠均出现明显脑梗死区(表 1)。5表 1 MCAO
15、后 2h 神经学评价与脑梗死的关系（略）Table 1 The relationship between neurological scores and cerebral infarction 2h after MCAO2.2 TTC 染色和脑梗死体积的变化 MCAO 再灌注后第 1 天，VIP 组和对照组大鼠的脑梗死体积分别为(15.723.52)%和(21.012.64)%(图 1)。VIP 组较对照组减少约 25%，差异有显著性(P0.05)。从具有代表性的 6 个 TTC 染色脑片(图 2)可以清楚看出上述的影响。在对照组未梗塞侧半球正常脑组织呈现鲜红色，而在栓塞侧半球大脑中动脉供血区
16、出现大面积明显的未被染色的白色缺血梗死区，主要位于尾壳核的外侧部和周围的额顶叶和颞叶上外侧皮质。受影响最明显的脑片是中部的 2-4 脑片(约在前囟前和后 3mm 之间的部位)。这是大脑中动脉的最主要供血区。与对照组相比，VIP 组大鼠尾壳核以及周围皮质的大部区域未受影响，梗死区明显减小。2.3 血清 S100 含量的变化 正常大鼠血清 S100 含量极低，本实验未能检测出。MCAO 再灌注后 1d，VIP 组大鼠血清 S100 含量较对照组明显降低(图 3)。对照组 ELISA 检测值为(8.430.82)g/L，VIP 组为(6.280.49)g/L，两组之间有显著性差异(P0.05)。图 1 缺血纹状体和皮质的梗死体积（略）Fig.1 The infarct volume in the ischemic striatum and cortex*P0.05 vs. control group图 2 MCAO 后 1d，VIP 组(左侧)和对照组(右侧)TTC
