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1、1保留残迹对前交叉韧带重建移植物愈合 影响的组织学研究【摘要】 ：目的观察保留残迹对前交叉韧带(anterior cruciate ligament，ACL)重建移植物愈合的影响，并探讨其原因。 方法新西兰兔 30 只(封闭群，体重 2.93.5 kg，平均 3.2 kg)随机分为 3 组，每组 10 只。取其跟腱为移植物，切断双侧前交叉韧带，随机一侧保留 ACL 残迹，对侧切除残迹，行前交叉韧带重建。分别于术后4、8、12 周处死动物，取关节内重建 ACL 移植物标本 10多聚甲醛固定、10EDTA 脱钙、包埋、切片，HE 染色及 Masson、PAS 特殊组织化学染色，检测成纤维细胞密度及
2、观察组织学形态，数据采用 SPSS 12.0 软件进行统计分析。 结果各时间段保留残迹组移植物 HE 染色组织切片成纤维细胞密度均高于切除残迹组，两组比较有显著统计学差异(P0.05)，两处理组 8 周时细胞密度高于4、12 周，不同时间段比较有统计学差异(P0.05)。各时间段保留残迹组移植物的组织学表现均优于切除残迹组。 结论保留残迹 ACL 重建有利于新生细胞长入替代移植物，促进移植物组织结构成熟。 【关键词】 膝关节 前交叉韧带 残迹 重建 愈合Abstract：ObjectiveTo observe the effects of preserving the remnant on h
3、ealing of ACL autograft in anterior cruciate ligament (ACL) reconstruction,and discuss the reasons.MethodForty closed colony New Zealand rabbits with the average weight of 3.2 kg were divided into 3 groups at random,each group had 10 rabbits.The anterior cruciate ligament of the rabbit was cut off i
4、n both knees,the remnant of original ACL was preserved on one side and removed on the opposite side at random,then single bundle anterior cruciate ligament reconstruction was conducted with autogeneous achilles tendon graft.Animals were executed and the intraarticlar graft specimens were taken at 4,
5、8,12,weeks postoperatively respectively.The specimens were fixed with 10 % paraformaldehyde,decalcified with 10% EDTA.The specimens were taken and embeded,sliced,and then strained with HE and Masson,PAS special histochemistry to 2observe fibroblast density and histopathological situation.Statistical
6、 analysis were carried out using SPSS 12.0 software.ResultIn each time section,the fibroblast density of ACL grafts tissue section with HE dyeing in preserving remnant group was higher than that in removing remnant group,there was significant difference between two groups (P0.05).The density of 8 we
7、ek time section was higher than those of 4 week time section and 12 week time section.There was significant difference among different time sections in each treatment group (P0.05),the histological appearance of ACL grafts of preserving remnant group was better than that of removing remnant group.Co
8、nclusionThe ACL reconstruction by preserving remnant is beneficial to the newborn cells/ growing in of the ACL grafts and beneficial to the histological maturity of the ACL grafts.Key words：knee; anterior cruciate ligament; remnant; reconstruction; healing前交叉韧带损伤是膝关节外伤中常见的损伤之一，应用自体半腱肌和股薄肌肌腱进行前交叉切带重建
9、的手术方法己逐渐成熟，其供区病损小、对伸膝装置无干扰、可取得与采用髌韧带重建类似的膝关节稳定效果，已成为国内外治疗 ACL损伤的主流重建方法1，重建术后移植物的良好愈合是手术取得成功的关键。近年来许多研究发现，原 ACL 残迹(remnant of ACL)对重建后移植物的再血管化以及细胞增殖有促进作用，并可促进神经再生，因此，保留残迹的手术方法可能更有利于移植物的愈合。目前已有相关的临床研究2,8,9，但动物实验还未见报道。本研究在动物实验对保留残迹 ACL 重建与切除残迹重建 ACL 进行组织学对比研究，以探讨保留残迹 ACL 重建的手术方法对 ACL 移植物愈合的影响。1 材料与方法1.
10、1 实验动物分组与处理新西兰兔(封闭群)，数量 30 只，体重（2.60.2）kg，雌、雄各半，用随机数字表进行随机化分组，按饲养时间 4、8、12 周分为 3 组，每组 10 只。动物麻醉后仰卧手术台上，屈膝 90 (图 1a)，取跟部后正中切口，切取跟腱外侧 23 作为移植腱。3将跟腱修整至长约 5 cm，直径为 2 mm，两端编织缝合，保留尾线作为牵引线(图1b)，置于生理盐水中备用。行关节外侧纵切口，将髌骨牵向内侧至脱位，暴露关节腔。切断 ACL，随机一侧保留上、下端残迹各约 2 mm 长，另一侧完全切除上下端残迹。沿原 ACL 方向，在定位器导引下在胫骨止点处向下、内用 2 mm 钻
11、头钻取胫骨隧道，同样方法，钻取股骨隧道，在牵引线引导下，将制备好的移植物植入骨隧道内，移植物两端拉出骨隧道外部分反折，并以牵引线拉紧缝合于隧道外口软组织上(图 2)，逐层间断缝合切口。术后不予外固定，分笼饲养， 自由活动。1.2 标本采集与处理于术后 4、8、12 周分别处死动物，打开膝关节腔，生理盐水冲洗关节。切取关节内重建的前交叉韧带的移植物标本，10多聚甲醛固定、10EDTA 脱钙，常规脱水、透明、浸腊、包埋。制备 5 的移植物纵向切片，分别行 HE 染色及Masson、PAS 特殊组织化学染色，显微镜下观察，记录观察结果。1.3 组织形态计量与数据处理HE 染色切片在 IPP(Imag
12、e Pro Plus System)通用医学图像分析系统(泰山医学院生命科学研究所提供)下随机取 5 个高倍视野(每高倍视野面积约 0.5 mm2)进行成纤维细胞核计数，取平均值，得出每高倍视野成纤维细胞密度。各组数据用s表示，使用 SPSS 12.0 统计软件进行时间段内方差分析、总体数据 23 析因分析。2 结 果2.1 显微形态观察结果44 周时，保留残迹组见较多新生细胞自外周侵入移植物，胶原纤维排列紊乱，PAS 着色淡；切除残迹组新生细胞侵入较少，胶原纤维排列更加紊乱，PAS 着色淡。8 周时，保留残迹组移植物可见大量新生细胞，主要为成纤维细胞，胶原纤维排列仍紊乱，PAS 着色有明显增
13、强(图 3a)；切除残迹组移植物可见大量新生细胞，但数量较保留残迹组少，胶原纤维排列紊乱，PAS 着色较保留残迹组淡(图 3b)。12 周时，保留残迹组移植物内细胞数有明显减少(图 4a)，形状多为长梭形，胶原纤维排列整齐(图 5a)，PAS 着色较好；切除残迹组移植物内细胞数较少(图 4b)，胶原纤维排列比较整齐，但较保留残迹组稍差(图 5b)，PAS 着色较保留残迹组淡。2.2 移植物成纤维细胞密度各组 HE 染色切片每高倍视野成纤维细胞计数(细胞密度)结果及 SPSS 12.0 统计软件 23 析因分析结果见表 1。可见各时间段保留残迹组移植物成纤维细胞密度均高于切除残迹组，两组比较均有
14、显著统计学差异(P0.05)。2 处理组在术后4 周时成纤维细胞密度较低，8 周时达到高峰最高，12 周时细胞密度降低(图 6)，8周时细胞密度明显高于 4、12 周，2 处理组不同时间段比较有统计学差异(P0.05)。时间与手术方法间存在交互效应(P0.05)。表 1 移植物成纤维细胞密度（略)注（1）#P0.05,P0.05,P0.05;(2)2 处理组 4、8、12 周比较P0.05。 3 讨 论前交叉韧带重建后自体肌腱移植物的愈合是一个复杂的过程，多数研究者着重于 ACL 重建移植物骨隧道内组织愈合过程即腱-骨愈合过程。近年来的研究普遍认为：骨隧道的内愈合首先形成一圈富含血管的纤维结缔
15、组织带（界面组织）填充5在腱与骨之间3，4，随后来源于隧道骨组织的成纤维细胞逐渐长入，形成连接，继而形成类似直接韧带-骨止点的结构5。关节内移植腱大致要经历缺血坏死、血管重建、细胞增殖和塑型成熟 4 个阶段，最终成为类似韧带的结构。这一过程主要由关节内组织细胞“爬行替代”重建 ACL 的移植腱。王永健等6应用半腱肌腱重建前交叉韧带术后观察关节腔内重建移植物组织学形态时发现：移植手术后第2 周，可见关节腔内的肌腱组织坏死，表现为细胞核溶解，新生的组织尚未长入替代；术后 1 个月，见到有大量新生的细胞从移植物外周向中心长入，新生细胞呈梭形，较正常半腱肌腱和前交叉韧带细胞的体积大；术后第 2 个月，
16、关节腔中的移植物富含细胞，呈类圆形，胶原纤维排列无序；术后第 4 个月，移植物中细胞数目接近正常前交叉韧带，细胞呈长梭形，胶原纤维纵向排列比较整齐；术后第 6 个月，移植物细胞数目和形态已经类似正常前交叉韧带，胶原纤维纵向排列整齐有序，并具有很好的弹性；术后第 9 个月，移植物组织学形态进一步成熟，细胞及胶原纤维排列更加整齐有序；术后第 12 个月，细胞形态更加类似正常前交叉韧带的短杆状并在局部出现成串状排列。在本实验中通过对每高倍视野成纤维细胞数量(细胞密度)的检测来评价移植物的愈合程度，发现术后 8 周时成纤维细胞密度最高，明显高于 4、12 周，这与王永健的研究结果一致，说明移植腱关节内愈合过程中，移植物细胞数量均经历先增多后下降过程。在临床中重建 ACL 手术时往往将原 ACL 的残迹完全清除，以更好地暴露韧带止点、定位骨隧道内口。近年来国内外许多学者逐渐认识到原 ACL 残迹对 ACL移植物的愈合有重要的促进作用。Georgoulis 等7研究认为原
