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1、1大鼠急性肾脏缺血再灌注后处理动物模 型的建立作者：陈光磊，王汉民，刘广厚，陈威，何丽洁，孙世仁，张鹏 【摘要】 目的：建立肾脏缺血后处理动物模型. 方法：将 40 只 SD 大鼠随机分为对照组、缺血再灌注组（IR 组）和 3 个缺血后处理组（IPO1，IPO2，IPO3 组），分别制作动物模型. IR 组在同时夹闭双侧肾动脉 45 min 后恢复血供，IPO1，IPO2 和IPO3 组在肾缺血 45 min 后分别采用不同的后处理方法，其中 IPO3 组采用反复10 次再灌注 20 s-缺血 20 s 的后处理方法. 恢复血供 24 h 后留取各组大鼠静脉血标本及肾组织，检测肾功能指标，光镜
2、下观察肾组织形态学变化并对肾小管损伤程度进行评分. 结果：IPO3 组血尿素氮为（27.93.2） mmol/L，血肌酐为（23249） mol/L，肾小管损伤程度评分为 38248. 和 IR 组相比，IPO3 组的血尿素氮、血肌酐及肾小管损伤程度评分均明显降低（P0.01），肾组织损伤明显减轻，其余两个缺血后处理组与 IR 组相比差异无统计学意义（P0.05）. 结论：在急性肾脏缺血后，采用 IPO3 组的方法可以减轻急性肾脏缺血再灌注损伤，从而成功建立大鼠急性肾脏 IRI 的后处理动物模型. 【关键词】 缺血后处理0 引言急性肾脏缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion
3、injury，IRI）是一种常见的临床病理生理过程，多见于低血容量性休克、急性肾动脉阻断以及肾脏移植等情况，可以造成急性肾衰竭或使移植肾功能延迟恢复. 因此，如何有效防止因急性肾脏 IRI2而导致的各种急慢性肾脏疾病是一个亟待解决的问题. 2000 年，陶凌等1在国内首先证实了缺血后处理（ischemic postconditioning，IPO）对急性心肌缺血再灌注兔心脏具有保护作用，此后，更多研究者2-4把研究对象拓宽到不同物种和不同器官，建立了 IPO 动物模型，并对 IPO 保护作用机制进行了探讨. 但是，肾脏 IPO是否同样具有对急性肾脏 IRI 的保护作用尚不清楚. 我们在大鼠急性
4、肾脏 IRI 模型基础上，探讨建立肾脏 IPO 大鼠模型的方法.1 材料和方法1.1 材料健康雌性 SD 大鼠 40 只，体质量（23610）g（第四军医大学实验动物中心），动物许可证号 SCXK（军 2002 005），标准饲料喂养，正常饮水，普通光照. 血尿素氮、血肌酐试剂盒（化学法）（南京建成生物工程研究所）；721 分光光度计（上海精密科学仪器公司）；光学显微镜（日本 Olympus 公司）.1.2 方法1.2.1 动物分组与模型制作将 SD 大鼠随机分为 5 组，每组 8 只. 缺血再灌注组（IR 组）：参考 Basile 等5的方法进行双侧肾脏缺血再灌注，建立缺血再灌注引起的急性肾
5、衰竭的动物模型. 将大鼠用 30g/L 戊巴比妥腹腔注射麻醉，去毛、固定，沿上腹部正中线逐层切开皮肤、腹直肌及腹膜，先后在结肠脾区及结肠肝区位置暴露左、右肾，游离左、右肾蒂，用玻璃分针小心分离出左、右肾动脉，然后用血管夹同时将双侧肾动脉夹闭，45 min 后同时松开双侧血管夹，恢复双侧肾脏血供. 缺血后处理 1 组（IPO1 组）：各缺血后处理组的手术方法基本同 IR 组. 在缺血45 min 后用血管夹同时给予双侧肾脏反复 5 次的恢复血供 3 min-阻断血供 3 min处理（即缺血后处理），再恢复血供. 缺血后处理 2 组（IPO2 组）：在缺血 45 min3后用血管夹同时给予双侧肾脏
6、反复 5 次的恢复血供 20 s-阻断血供 20 s 处理，再恢复血供. 缺血后处理 3 组（IPO3 组）：在缺血 45 min 后用血管夹同时给予双侧肾脏反复 10 次的恢复血供 20 s-阻断血供 20 s 处理，再恢复血供. 对照组（S 组）：手术方法基本同 IR 组，但仅分离出大鼠双侧肾动脉，不进行夹闭.1.2.2 标本留取在末次恢复肾脏血供 24 h 后将大鼠用 30 g/L 戊巴比妥腹腔注射麻醉，固定，分离下腔静脉，用注射器采血 23 mL，用于血液生化指标检查；然后用冰生理盐水经肾动脉对肾脏进行灌注直至肾脏发白，取下双肾，留取部分组织做光镜检查.1.2.3 指标观察肾功能：采用
7、化学比色法检测血尿素氮及血肌酐. 肾脏组织形态学：部分肾组织用 100 mL/L 甲醛固定，常规脱水、包埋、切片后，行 HE 和PAS 染色，光镜下观察形态，参考 Paller 等6的方法进行评分，每只大鼠肾组织随机选择 10 个无重叠视野（200），每个视野下随机选择 10 处肾小管，共按 100个肾小管计分，分数越高表示肾小管损伤程度越严重.统计学处理：所得数据采用 xs 表示，采用完全随机设计的单因素方差分析（ANOVA），多组之间的两两比较采用 LSD t 检验，应用 SPSS 13.0 软件进行统计学处理，以 P0.05 为差异有统计学意义.2 结果2.1 血尿素氮及肌酐与 S 组相
8、比， IR， IPO1， IPO2， IPO3 组的血尿素氮及血肌酐均显著增高（P0.01）. 与 IR 组相比，IPO1 组的血尿素氮和血肌酐略有增高、IPO2 组略有降低，但均无统计学意义（P0.05），IPO3 组的血尿素氮和血4肌酐均明显降低，差异有统计学意义（P0.01，表 1）.表 1 各组 SD 大鼠血尿素氮、血肌酐及肾小管损伤程度评分的比较（略）2.2 肾脏组织形态学的变化2.2.1 肾小管损伤程度的评分与 S 组相比，IR，IPO1，IPO2，IPO3 组的肾小管损伤程度差异有统计学意义（P0.01）. 与 IR 组相比，IPO1 组的肾小管损伤程度更重（P0.05），IPO
9、2 组的肾小管损伤程度略轻，但无统计学意义（P0.05），IPO3 组的肾小管损伤程度明显减轻（P0.01，表 1）.2.2.2 肾脏组织形态学改变在光镜下 S 组大鼠肾组织结构正常，肾小管、肾间质未见明显病理改变（图 1A）. 经过再灌注 24 h 后，IR 组大鼠肾组织中可见间质水肿，肾小管上皮细胞刷状缘消失，大量上皮细胞脱落、坏死，基底膜裸露，管腔明显扩张，管腔内可见大量管型（图 1B）. IPO3 组大鼠肾组织中可见间质轻度水肿，肾小管上皮细胞扁平，部分刷状缘脱落消失，部分管腔扩张，可见少量管型，相对IR 组病理改变明显减轻（图 1C）.图 1 各组 SD 大鼠肾脏形态学改变 PAS
10、200 略3 讨论1986 年，Murry 等7发现在急性缺血再灌注出现之前对心脏进行反复多次的短暂缺血再灌注（即缺血预处理）可以减轻心脏的 IRI，此后，Islam 等8证实了预处理对肾脏急性 IRI 同样有保护作用. 然而在临床中，如果一旦发生 IRI，则预处理难以实施，因此，研究在缺血后对再灌注进行处理更具有实用价值. 2000 年，我5国学者1首先证实了 IPO 对急性心肌 IRI 具有保护作用，此后，Zhao 等2和Kin 等9的研究分别证明了 IPO 可以减轻犬和大鼠心脏 IRI. 不仅在心脏，随后的一些研究针对肝脏3、脑4等组织进行 IPO，证实对其相应器官的 IRI 也可产生保
11、护作用，并对保护作用机制进行了探讨. 但是，以往的国内外众多研究并未涉及到肾脏器官，而且针对大鼠心脏等器官的研究中，单次后处理的时间和后处理的循环次数也不尽相同10，因此，在开展针对肾脏 IPO 作用效果及作用机制的研究之前，首先需要建立成功的大鼠肾脏 IPO 模型. 在国外许多大鼠缺血再灌注的急性肾衰模型研究5, 11中，都将肾脏缺血时间限定在 45 min，我们在本研究中同样将缺血时间限定在 45 min，通过预实验成功复制了大鼠急性肾脏 IRI 模型. Yang 等12通过对研究发现，如果在开始再灌注 10 min 后再进行后处理将丧失对 IRI 的保护作用，更多的研究9,13发现，如果
12、在开始再灌注 1 min 之后再进行后处理，同样会使其对心肌 IRI 的保护作用丧失. 最近，Tang 等10的研究显示，不同的后处理循环次数和心肌梗死面积有关，单次后处理时间过长、后处理循环次数过少都有可能限制其心肌保护作用的发挥. 因此，我们在成功复制了大鼠急性肾脏 IRI 模型的基础上，重点针对单次后处理的时间和后处理的循环次数进行了研究，以期成功建立大鼠急性肾脏 IRI 的后处理动物模型.我们在实验中对大鼠肾脏缺血后采用了 3 种不同的后处理方式，从功能学和形态学角度对后处理的效果进行了分析，以便选择合适的肾脏缺血后处理动物模型. 结果显示，相对于 IR 组，采用反复 5 次恢复血供
13、3 min-阻断血供 3 min 的后处理（IPO1 组）并不能减轻急性肾脏 IRI，反而可能加重损伤；采用反复 5 次恢复6血供 20 s-阻断血供 20 s 的后处理（IPO2 组）能使肾功能指标改善，但无统计学意义. 而采用反复 10 次恢复血供 20 s-阻断血供 20 s 的后处理组（IPO3 组）和 IR 组相比，肾功能指标明显改善，肾组织中未见肾小管上皮细胞脱落和基底膜裸露，间质水肿、刷状缘消失、管腔扩张、管型等改变也较 IR 组轻，对肾小管损伤程度评分的分析同样支持上述结果.综上所述，在急性肾脏缺血后及时采取反复 10 次的短暂（恢复血供 20 s-阻断血供 20 s）后处理，
14、可以减轻急性肾脏 IRI，从而成功建立大鼠急性肾脏 IRI 的后处理动物模型，为进一步研究 IPO 对大鼠肾脏的保护作用机制奠定了基础.【参考文献】1 陶凌, 李源, 高峰,等. 缺血后处理对急性心肌缺血再灌注兔心脏的保护作用J. 第四军医大学学报, 2000, 21(6): S116-S118.2 Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME, et al. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic prec
15、onditioningJ. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003, 285(2):H579-H588.3 Sun K, Liu ZS, Sun Q. Role of mitochondria in cell apoptosis during hepatic ischemia reperfusion injury and protective effect of ischemic postconditioningJ. World J Gastroenterol, 2004, 10(13): 1934-1938.4 Danielisova V, Nemetho
16、va M, Gottlieb M, et al. The Changes in Endogenous Antioxidant Enzyme Activity After PostconditioningJ. Cell Mol Neurobiol, 2006, 26(7 8):1179-1189.5 Basile DP, Donohoe D, Cao X, et al. Resistance to ischemic acute renal failure in the Brown Norway rat: a new model to study cytoprotectionJ. Kidney Int, 2004, 65(6):2201-2211.6 Paller MS, Hoidal JR, Ferris TF. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in t
