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1、1利用基因芯片分析孕妇外周血浆 APC 基 因甲基化的初步研究作者:黄钧，葛芹玉，蒋犁，蒋小青，陆祖宏【摘要】 目的 研究孕妇外周血浆中 APC 基因甲基化模式与孕妇妊娠状态的关系，探讨其应用于无创性产前诊断的可行性。方法 从不同妊娠时期孕妇和健康未孕妇女外周血浆标本中提取 APC 基因，经过亚硫酸氢钠转化后，利用基因芯片方法检测分析 APC 基因启动区一组 CpG 位点的甲基化模式，并对不同妊娠时期以及健康未孕样品进行了分析比较。结果 健康未孕妇女血浆中 APC 基因是未甲基化或低甲基化的，而在妊娠状态下是高甲基化状态的，但不同妊娠时期甲基化程度有所不同。结论 孕妇外周血浆 APC 甲基化模
2、式的变化与妊娠状态和时间均有一定的关系，基因芯片方法可以高通量的检测分析血浆 DNA 甲基化状态。血浆DNA 甲基化的分析进一步应用于无创性产前诊断具有可行性。【关键词】 无创性产前诊断；DNA 甲基化；基因芯片；APC 基因A microarray to analyze methylation pattern of the APC gene in maternal plasma in pregnant woman【Abstract】 Objective Detection of the relationship between methylation pattern of the APC g
3、ene in maternal plasma in pregnant woman and the state of pregnancy， and estimation the potentiality that applicate to noninvasive prenatal diagnosis. Methods Plasma DNA was isolated from peripheral blood of pregnant women， then after bisulphate-treat， the methylation pattern of CpG site in the APC
4、promoter were analyzed by DNA microarray-based method. The methylation pattern of differential stages in pregnant women and nonpregnant women were compared by DNA microarray. Results The methylation prattern of CpG site in the APC promoter in healthy nonpregnant women are densely methylation and in
5、pregnant women are 2hypomethylation or unmethylation. The degree of methylation in pregnant women are distinction. Conclusion There are relationship between the methylation pattern of the APC gene in maternal plasma in pregnant women and the pattern of the differential stages and times of pregnancy.
6、 The DNA microarray can be applied as a high throughput tool to map methylation patterns in CpG island sites. The analysis of DNA methylation in plasma will have the powerful potentiality that applicate to noninvasive prenatal diagnosis. 【Key words】 DNA methylation; noninvasive prenatal diagnosis;ge
7、ne microarray; APC gene1997 年，Lo 等1首次报道在母体血循环中发现了游离胎儿 DNA，证实了母体血浆中的 DNA 是胎儿和母体 DNA 的混合体，这一发现为无创性产前诊断开辟了新的方法。但以往对孕妇外周血中游离胎儿 DNA 的应用大多局限在检测胎儿从父亲一方继承来的基因或突变，且检测的胎儿基因必须能与母亲 DNA 序列显著区分开来。2002 年， Poon 等2利用后生性标志，如胎儿与母体 DNA 甲基化的差异来区分两者，冲破了上述限制，这种表遗传上的差异为无创性产前诊断提供了新的思路。但是，对在妊娠与未孕妇女外周血浆中基因甲基化模式是否存在一定的关系，在不同妊娠
8、期之间孕妇血浆中基因的甲基化模式是否存在一定关系等问题，目前还没有报道。正常妊娠时，细胞滋养层细胞侵入子宫蜕膜及其脉管系统，其发生在妊娠 818周之间，侵入过程与癌细胞在转移的时候有一些相似，因为细胞必须通过基底层。先兆子痫的发病机制可能与滋养层细胞在妊娠前 3 个月侵入子宫肌层失败有关。Muller 等3发现妊娠妇女和转移性乳腺癌病人在 APC 基因甲基化的改变上存在相似性。因此，本实验选择 APC 基因作为研究对象。本实验以妊娠不同时期 APC 基因启动区不同 CpG 位点甲基化模式为基础，通过3基因芯片对其变化规律进行探索性研究，寻找出它们之间的差异，以期可以作为生理或疾病状态的标志物，
9、并进一步应用于无创性产前诊断。1 资料与方法1.1 研究对象 从 2005 年 5 月8 月在东南大学附属中大医院妇产科进行产前检查的初孕妇中，随机选择 82 例作为研究对象，其中妊娠 412 周(早期)24 例，1327 周(中期)24 例，2840 周(晚期)24 例，产后 1 周 10 例。年龄 2335 岁，初孕，临床无感染征象，无其他产科合并症及并发症。同时随机选取未孕健康女性18 例作为阴性对照组。1.2 标本收集和处理 对所有研究对象抽取 5ml 外周血 EDTA 抗凝。在 24h 内，先 1600g 离心 10min 初步分离血浆，再于 16000g 下离心 10min，充分去
10、除细胞碎片等，获得纯净的血浆样品，血浆 DNA 采用标准酚氯仿方法提取。1.3 血浆 DNA 的亚硫酸转化 取 8l 的 DNA 加双蒸水至 20l ，加 3M 的NaOH 2l 解链，42水浴 15min。在每个样品中加入 5M 的对苯二酚/亚硫酸氢钠溶液 360l，50水箱孵育 1216h。DNA 过柱纯化(prgmaga 公司)。将 DNA 转移入新 EP 管中，加入 3M 的 NaOH 5l，水浴 15min。醋酸钠、无水乙醇沉淀 DNA。次日用 30l 的 TE 重新溶解。 1.4 APC 基因的不对称 PCR 扩增 APC 基因上游引物 5-GGGGTTAGGGTTAGGTAGG-
11、3，下游引物 5-AACTACACCAATACAACCACATA-3。PCR 反应体系：反应体积 25l，包括10PCR buffer(有 MgCl2) 2.5l，10mmol/L Cy3-dNTP 2l，10mmol/L 上游引物0.5l，10mmol/L 下游引物 2.5l，模板 DNA 1l，5u/l Taq 酶 0.2l，灭菌双蒸水418.5l。PCR 扩增条件：95 3min 预变性，94 30s 变性，57 30s 退火，72 40s延伸，40 个循环，72延伸 8min，4保存。1.5 基因芯片的制备 在洁净的载玻片上，用 2ml 1.2%的琼脂糖溶液均匀的平铺在玻片表面，待其凝
12、固后置于 37烘干。使用前将其浸泡于 0.1molL 的 NaIO4溶液中 30min，再用蒸馏水洗片 3 次，每次 5min，晾干后备用。在 APC 基因启动子区甲基化位点较多的区域设计了 16 个 CpG 位点(分布于 5 个探针)和一个阴性对照，6 个探针点样于膜片上。探针固定后备用。1.6 芯片杂交 在各管中加入 15l 的转化产物和 15l 的杂交缓冲液，置于 95水浴锅变性 7min。将变性好的杂交液滴于玻片上的点样区，并用 18mm18mm 盖玻片盖于其上，然后避光置于 37杂交 2h，分别用 2SSC+0.2% SDS 液、0.1% SSC+0.2% SDS 液、0.1% SS
13、C 液洗涤共 10min，室温晾干后用 ScanArray 5000 扫描仪扫描。1.7 芯片扫描和结果判定 对芯片扫描得到 Cy3 图像文件通过圈点确定杂交范围，过滤背景噪声，提取基因表达的荧光信号强度值，用预先定的内参照基因(植物基因) 对 Cy3 的原始提取信号进行均衡和修正；用 stroppro2.0 软件分析 Cy3 荧光信号的强度和比值。用以下 3 个条件作为判定基因阳性表达的标准: (1)Cy3 阳性点的荧光信号平均值超过阴性点信号的 3 倍，ratio 比值范围在 2.73.3； (2) 阴性荧光信号值600，Cy3 阳性荧光信号值减去阴性荧光信号值后400；(3)PCR 结果
14、良好。1.8 统计学处理 以上杂交过程均重复 3 次，数据取 3 次试验结果的平均值，数据以均值标准差 (xs )表示。用统计学处理采用 SPSS11.5 分析软件进行方差分5析和 SNK 法进行统计分析比较。统计检验的显著性设在 P0.05。 2 结果2.1 血浆 DNA 的亚硫酸氢钠转化 提取出的血浆 DNA 经亚硫酸氢钠预处理后，非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，随后进行 PCR 扩增，此过程进一步将模板上的尿嘧啶转化为胸腺嘧啶；而甲基化的胞嘧啶不受影响，保持不变。根据所选引物，APC 的扩增片段为 178bp，见图 1。1:健康 2：产后 3、4:早期5、6:中期 7、8:晚期 M：mark
15、er图 1 亚硫酸氢钠转化后 APC 基因扩增产物的琼脂糖电泳结果2.2 基因芯片的杂交结果2.2.1 中期妊娠和健康未孕样品中 APC 启动子区甲基化模式比较 图 2 中 2 与 5显示其芯片扫描结果，由图中可见，在妊娠中期 c、d 探针上杂交点的信号相对较强，在未孕妇女样本中荧光强度值较弱，杂交扫描后 s-median 532 值组间方差分析表明差异有显著性(P0.05)，说明 APC 基因在健康妇女血浆中是低甲基化或未甲基化的，而在妊娠状态下是高甲基化的。从而表明妊娠对血浆 DNA 甲基化程度有着较多的影响，妊娠妇女与健康未孕妇女的甲基化状态有比较明显的差异。DNA 甲基化作为一种新的产
16、前诊断的标志物可以应用于产前诊断，为无创性产6前诊断的发展打下了基础。图中 a、b、c、d、e、f 分别表示 APC 启动区不同 CpG 位点AP1、AP2、AP3、AP4、AP5 的杂交结果，1、2、3、4、5 代表妊娠的早期、中期、晚期、产后 1 周、健康未孕五种妊娠状态。图 2 妊娠各时期芯片杂交结果图 3 妊娠各期与健康未孕妇女 APC 启动子区不同 CpG 位点荧光信号图谱及分析2.2.2 不同妊娠时期及未孕样品中 APC 启动子区甲基化模式比较 笔者进一步对不同妊娠时期 APC 甲基化变化情况进行了比较，见图 2 妊娠各时期芯片杂交结果及图 3 妊娠各期与健康未孕妇女 APC 启动子区不同 CpG 位点荧光信号图谱及分析。妊娠中期和晚期样品检测结果中 APC 基因的甲基化状态有相似的模式，而在妊娠早期有较大的差异，杂交扫描后 s-median 532 值 SNK 分析表明早、中、晚妊娠期 b 探针上差异有显著性(P0.01)，说明不同的
