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1、1实验一 二苯胺法测定 DNA 含量【实验目的实验目的】1掌握 721 型分光光度计的工作原理及操作方法。2掌握二苯胺法测 DNA 含量的原理和方法。【实验原理实验原理】DNA 酸解后生成嘧啶核苷酸、嘌呤、磷酸和脱氧核糖。脱氧核糖在酸性环境中脱水生成 -羟基-酮基戊醛，它与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，在 595nm 处有最大吸收。样品中DNA 浓度 50500g/mL 范围内，光密度与 DNA 的浓度成正比，可用比色法测定。【实验仪器与试剂实验仪器与试剂】1 1仪器仪器(1)试管、吸量管、容量瓶、试管架(2)721 分光光度计(3)恒温水浴锅(4)分析天平2 2试剂试剂(1)DNA 标准溶液
2、：取 DNA 钠盐(经定磷确定其纯度)用 5mmol/L NaOH 配成 200gmL 的溶液。(2)二苯胺试剂：称取纯二苯胺（如不纯，需在 70乙醇中重结晶 2 次）1g 溶于 100mL 冰醋酸(AR)中，再加入 10mL 过氯酸(AR ，60以上)，混匀待用。临用前加入 1mL 1.6乙醛溶液，所配得试剂应为无色，贮于棕色瓶中。(3)1.6乙醛：取 47乙醛 34mL，加重蒸水定容至 100mL(保存于冰箱中，一周内使用)。(4) DNA 样液：将 DNA 干燥粗制品以 5mmol/L NaOH 溶液配制成 100gmL 的溶液。【实验操作实验操作】1标准曲线的制作：取 14 支试管，分
3、为 2 组（管号为：06，06）按下表操作。以 DNA 含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。2样品的测定：取 2 支试管（7 号和 7号）各加入 2mL 样品液(内含 DNA 应在标准曲线的可测范围之内)，按下表操作。2表 1 DNA 含量的测定试 管试 剂0（0） 1（1）2（2）3（3） 4（4） 5（5） 6（6）7（7）DNA含量（g） 0 40 80 160 240 320 400 DNA标准溶液（mL） 0 0.2 0.4 0.8 1.21.6 2.0 蒸馏水（mL） 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 样品液（mL） 2.0二苯胺试剂（mL）4.0 4.
4、0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0混匀，60恒温水浴保温60minA595A595【计算计算】根据测得的光密度值，从标准曲线上查 DNA 的含量，按下式计算制品中 DNA 的百分含量：DNA%= 100待测液中测得的 DNA 微克数待测液中制品的微克数3实验二实验二 酵母酵母 RNARNA 的提取与鉴定的提取与鉴定【实验目的实验目的】掌握 RNA 的提取及鉴定核酸组分的方法【实验原理实验原理】酵母中 RNA 含量较高。RNA 可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到 RNA 的粗制品。核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮
5、沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。【实验材料、仪器和试剂实验材料、仪器和试剂】1实验材料实验材料酵母粉2 2仪器仪器(1)恒温水浴(2)离心机(3)乳钵、移液管、锥形瓶(4)试管、试管架、量筒、烧杯、滴管3 3试剂试剂(1)0.04molL NaOH 溶液(2)酸性乙醇溶液：将 O.3mL 浓 HCl 加入 30mL 乙醇中(3)1.5molL H2s04 溶液(4)0.1molL 硝酸银溶液(5)三氯化铁浓盐酸溶液：将 2mL 10三氯化铁溶液(用 FeCl36H20 配制)加入到 400mL浓 HCl 中。(6)苔黑酚乙醇溶液：溶解 6g 苔黑酚于 100mL 95乙醇中。(
6、7)定磷试剂17H2S04溶液：将 17mL 浓 H2S04(比重 1.84)缓缓加入到 83mL 水中。2.5钼酸铵溶液：将 2.5g 钼酸铵溶于 100mL 水中。410抗坏血酸溶液：10g 抗坏血酸溶于 100mL 水中，贮棕色瓶保存。临用时按:水=l:l:l:2(VV)混合。(8)浓氨水【实验操作实验操作】1RNA 粗品的制备 将 1.5g 酵母悬浮于 9mL O.04molL NaOH 溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至 50mL 锥形瓶中。在沸水浴上加热 30min 后，冷却。3000rmin 离心15min。将上清液缓缓倾入 3mL 酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓
7、倾人。待核糖核酸沉淀完全后，3000rmin 离心 3min,弃去清液。用 95乙醇洗涤沉淀两次。沉淀可在空气中干燥。2核酸的水解 向上述沉淀物中加入 1.5molL H2S04溶液 10mL，在沸水浴中加热 10min制成水解液。3组分的鉴定(1)嘌呤碱取水解液 lmL 加入过量浓氨水，然后加入约 lmL O.1molL 硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。(2)核糖取 1 支试管加入水解液 lmL，三氯化铁浓盐酸溶液 2mL 和苔黑酚乙醇溶液 0.2mL。置沸水浴中 10min。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。(3)磷酸取 1 支试管，加入水解液 lmL 和定磷试剂 lmL。在
8、水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。 【实验结果实验结果】5实验三实验三 氨基酸的纸层析氨基酸的纸层析【实验目的实验目的】掌握纸层析的一般原理和操作技术。【实验原理实验原理】纸层析属于分析层析的一种，以滤纸作为支持物。滤纸作为一种多孔物质，又由于其本身纤维素和水有较强的亲和力（纤维素上的羟基与水以氢键相连） ，可以吸附很多水分（一般达滤纸重的 22%左右） ，使水的扩散作用降低而形成静止相。有机溶剂与纤维素亲和力很弱，可以在滤纸的毛细孔中自由流动，便形成流动相。由于各种物质极性不同则在两相间的分配数量不同，所以移动的速度不同。分配层析就是利用各种物质的分配系数不同而达到分离目的
9、。分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中所具有的浓度之比。分配系数= 在恒定条件（如纸层析溶剂、展层浓度、pH 等）下，分配系数是一个常数。层析溶剂一般选用水和有机溶剂组成。【实验仪器和试剂实验仪器和试剂】1、仪器仪器 （1）层析缸（2）吹风机（3）猴头喷雾器（4）镊子（5）层析滤纸（新华 1 号）：8*10cm（6）玻璃漏斗及漏斗架（7）微量注射器或毛细管2 2、试剂试剂溶质在固定相中的浓度溶质在流动相中的浓度6（1）氨基酸溶液：分别配制 0.5%的赖氨酸、脯氨酸和缬氨酸的水溶液以及它们的混合液（各组分浓度均为 0.5%）5mL。（2）显色剂（0.5%茚
10、三酮-丙酮溶液）：称取 0.5g 茚三酮溶于 100mL 丙酮中，贮于棕色瓶中。（3）展层剂（水饱和的正丁醇：醋酸=4：1）：将 20mL 正丁醇和 5mL 冰醋酸放入分液漏斗中，与 15mL 蒸馏水混合，充分振荡，静止分层后，放出下层水层，漏斗内的溶液即为展层剂。临用前配制。【实验操作实验操作】1先将少量展层剂沿漏斗倒入层析缸中一侧，以平衡内部空间。2用镊子取层析滤纸，在距一边缘 2cm 处用铅笔划一条直线，平均标记四个点。3用毛细管分别取各种氨基酸样品点在 4 个位置上，用电吹风冷风吹干。重复 1 次。每次点样在滤纸上扩散的直径最大不超过 3mm。4将展层剂倒入层析缸中，液面高度约为 1c
11、m，并将滤纸立于层析缸中（展层剂不可浸没样点） 。待展层剂上升距滤纸顶部边缘约 0.51cm 处停止层析，取出滤纸，用铅笔标出前沿界线，立即用电吹风冷风吹干。5用喷雾器均匀喷洒显色剂（一定要喷均匀，不要过多） 。放入 60-65C 烘箱中烘干或用电吹风热风吹干，即可显出各层析斑点。【结果计算结果计算】根据各谱点在滤纸上的移动速率 Rf值来判断样品中可能含有的氨基酸种类。Rf= 原点到层析点中心的距离 r原点到溶剂前沿的距离 R7实验四 Bradford 法测定蛋白质含量【实验目的实验目的】1熟悉 721 型分光光度计的使用方法。2掌握考马斯亮蓝 G250 法测定蛋白质含量的原理和方法。【实验原
12、理实验原理】在蛋白质的分离、纯化过程中，往往需要有一种快速、灵敏的方法对蛋白质进行定量测定。近年来被广为采用的 Bradford 法满足了人们的需要。本方法采用考马斯亮蓝G250(Coomassilebrilliant blue，G250，简称 CBBG250)作为染色物质。依其存在形式不同可表现为红色和蓝色，当 CBBG250 单独存在时为红色；当其与蛋白质结合后，其颜色变为蓝色。蓝色的深浅与溶液中的蛋白质含量(01000g/mL)成正比，故可用于测定蛋白质含量。该方法快速、重复性好、干扰因素少，CBBG250 在 2 分钟内即可完全与蛋白质结合，并在 lh 内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾
13、等阳离子干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的于扰。但较高浓度的十二烷基硫酸钠，Triton x 一 100 等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照来消除。【实验材料、仪器与试剂实验材料、仪器与试剂】1 1实验材料实验材料新鲜血清2 2仪器仪器(1)721 分光光度计(2)容量瓶(3)试管和吸量管2 2试剂试剂(1)考马斯亮蓝 G250 溶液：称取 CBB-一 G250 lOOmg 溶于 50mL 95的乙醇溶液中，然后加入 100mL 85的磷酸，最后加蒸馏水定容至 1000mL。(2)标准蛋白质溶液(100g/mL)：精确称取 10mg 牛血清白蛋白，用 0.9氯化钠溶液定容至 100mL。(3
14、)生理盐水8【实验操作实验操作】1 1制作标准曲线制作标准曲线取 12 支试管，按下表操作管试 别剂0（0） 1（1） 2（2） 3（3） 4（4） 5（5）标准蛋白质溶液(mL) 0.2 0.4 0.6 0.8 10生理盐水(mL) 10 0.8 0.6 0.4 0.2CBB-G250溶液(mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀，放置 2min，于 595nm 处比色，记录光密度值(OD 值)。以蛋白质含量为横坐标，光密度值(OD 值)为纵坐标，绘制标准曲线。2 2样品测定样品测定取 2 支试管，各加入 1 mL 稀释的样品，再加入 5 mL CBB-G250 溶液混匀，
15、放置 2min，于595nm 处比色，查标准曲线，求得蛋白质含量。【计算计算】9实验五 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白【实验目的实验目的】掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的原理和操作方法。【实验原理实验原理】聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，聚合交联而成的三维网状结构的高分子聚合物，其网孔大小可由凝胶浓度加以调节。因此用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物时，被分离物质由于所载电荷及其分子大小和形状的差异，在电场作用下以及凝胶网孔的“分子筛”作用下产生不同的移动速度而互相分离。所以此方法具有电荷效应和“分子筛”效应的双重特性。因为这一方法具有设备简单、操作方便、时间短、样品用量少、不易扩散等优点，所以它是鉴定酶和分离蛋白质的有力工具。【实验材料、仪器与试剂实验材料、仪器与试剂】1 1实验材料实验材料牛血清2 2仪器仪器(1)SCR 型稳流稳压电泳仪(2)微型凝胶电泳设备(3)
