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1、代谢组学研究方法及其在放射医学领域的应用展望代谢组学研究方法及其在放射医学领域的应用展望摘要：机体暴露于电离辐射下，一系列分子表达活性将发生变化，特异性改变的代谢产物可作为标志物用于辐射损伤的鉴别分类 ，该文综述了目前已经确定的或具有潜在功能的几种辐射损伤标志物的应用价值，介绍了代谢组学研究方法用于辐射损伤的诊断和治疗的目前研究进展。关键词： 代谢组学 放射医学 辐射损伤标记物代谢组学是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量 1000 以内的小分子物质。基因组学和
2、蛋白质组学分别从基因和蛋白质层面探寻生命的活动，而实际上细胞内许多生命活动是发生在代谢物层面的，如细胞信号释放（cell signaling），能量传递，细胞间通信等都是受代谢物调控的。代谢组学正是研究代谢组（metabolome）在某一时刻细胞内所有代谢物的集合的一门学科。基因与蛋白质的表达紧密相连，而代谢物则更多地反映了细胞所处的环境，这又与细胞的营养状态，药物和环境污染物的作用，以及其它外界因素的影响密切相关。因此有人认为，“基因组学和蛋白质组学告诉你什么可能会发生，而代谢组学则告诉你什么确实发生了。”由于代谢组学的研究对象代谢(物)处于生物系统生化活动调控的末端，包含着反映生理现象的直
3、接而又全面的生物标志物(biomarker)信息，而且代谢物的种类少于 3000 种，与其他组学所研究的对象相比要少得多，比较容易鉴定和定量，因此，代谢组学日益成为整体研究生命体系功能变化的有力的分析手段，目前已经应用于新药研发、疾病诊断及发病机制阐明等领域，显示出广阔的应用前景1。随着代谢组学技术平台的不断发展，该技术也已开始应用到放射医学领域，寻找代谢产物中与辐射剂量相关的生物标志物，将对辐射生物剂量学的发展具有重要的推动作用。现将代谢组学的主要技术手段，以及在放射医学领域的应用现状和前景展望综述如下。代谢组学研究方法代谢组学研究方法 代谢组学的研究方法与蛋白质组学的方法类似，通常有两种方
4、法。一种方法称作代谢物指纹分析 （metabolomic fingerprinting），采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）的方法，比较不同血样中各自的代谢产物以确定其中所有的代谢产物。从本质上来说，代谢指纹分析涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立一套完备的识别这些不同化合物特征的分析方法。另一种方法是代谢轮廓分析（metabolomic profiling）,研究人员假定了一条特定的代谢途径，并对此进行更深入的研究。 对于代谢产物来说，不仅只有质谱峰这个特征。更进一步说，质谱（MS）并不能检测出所有的代谢产物，并不是因为质谱的灵敏度不够，而是由于质谱只能检测离
5、子化的物质，但有些代谢产物在质谱仪中不能被离子化。代谢组学主要研究的是作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物（MW1000）。利用代谢组学工具发现辐射损伤在动物体内的相关生物标志物。代谢组学检测的生物样品，包括生物体的各种体液，尿液、血浆或血清、脑脊液、精液、胆汁、细胞提取物以及生物组织样品皮脂等。由于尿液、血浆或血清取样无侵性的特点，因而被广泛用于代谢组学分析。很多因素对生物体的代谢有影响，如动物的品系、性别、饮食、年龄、昼夜循环、药物干预等阻2。因此，在实验设计时，要充分考虑到这些因素对实验的影响，样本收集时尽量使这些影响因素最小化。完整的代谢组学分析流程如下。1样品制备：包括样品的提
6、取、预处理和化合物的分离。在样本准备阶段，所用的提取方法(包括液一液提取、固相提取、过滤等)应该尽可能多地提取代谢物 3。分析之前，常先用固相微萃取、固相萃取、亲和色谱等预处理，用气相色谱、液相色谱、毛细管电泳等进行化合物的分离。2数据采集的仪器分析平台：有多种分析技术用于代谢组学的分析研究，主要包括核磁共振波谱(NMR)、质谱(MS)及质谱联用技术。每种分析技术都可以帮助了解生物体代谢物的动态水平。由于所分析对象的生化多样性及浓度的差别较大，要对它们进行无偏差的全面分析，单一的分离分析手段难以胜任，这就是为什么代谢组学需要众多技术和数据联用的原因。主要技术手段是核磁共振（NMR），质谱（MS
7、），色谱（HPLC，GC），其中以 NMR 为主。通过检测一系列样品的 NMR 谱图，再结合模式识别方法，可以判断出生物体的病理生理状态，并有可能找出与之相关的生物标志物（biomarker）。为后期辐射损伤提供一个预知平台。3数据预处理及分析：代谢组学分析产生的是大量的多维信息，因此，充分运用化学计量学，对采集的多维海量原始数据进行压缩降维和归类分析，从中有效挖掘出有用信息，对代谢组学分析结果的最终解释至关重要。二、代谢组学在放射医学研究中的应用二、代谢组学在放射医学研究中的应用自 1895 年伦琴(W C Roentgen)发现 X 射线以来，放射医学经历了 110 余年的发展历程。电离辐
8、射在为人类带来巨大裨益的同时，也使生物机体受到不同程度的健康危害。放射医学是医学中的一门学科，其主要任务是研究电离辐射对人体的作用、机制、损伤与修复的规律，放射损伤的诊断、治疗和预防，为放射性工作人员的卫生防护、医学监督和保健工作提供理论依据和措施。电离辐射能够引起 DNA 损伤、细胞凋亡、坏死，造血和免疫功能低下、基因突变和肿瘤发生等多种病理改变。对于电离辐射损伤的分子机制和诊断方法的研究虽然不断深入，但是仍有很多未知的问题尚未解决。代谢组学作为一种新兴学科，在心血管疾病、肿瘤疾病的发病机制和诊断标志物研究中已得到广泛应用，并取得可喜的进展。放射损伤是机体受到电离辐射后引起的一种病理状态，同
9、样也会引起代谢产物变化。针对放射损伤后的代谢产物变化开展研究将有利于寻找放射损伤诊断的生物标志物，阐明放射损伤的分子机制。目前，代谢组学的研究主要集中于用实验动物和细胞寻找机体与放射应激反应相关的候选生物标志物(群)，以便用于放射损伤诊断。目前，辐射损伤的处理措施主要依据欧洲已经建立的比较完善的辐射损伤鉴别分类方案和辐射损伤治疗方案，这两个方案要求，应在辐射损伤 48h 内，根据患者的临床性状确定治疗手段。生物标志物作为机体接触辐射后出现的一种改变，是指能反映机体与辐射相互作用所引起的生理、生化、免疫和遗传等多方面分子水平改变的物质。通过对生物标志物的自动化检测，能够快速地判断受辐射人群的数量
10、以及评估辐射损伤的程度。以往，仅仅通过患者的临床症状制定辐射事故的救治方案，生物标志物的出现为救治方案的进一步完善提供了新的鉴别诊断依据，尤其对那些辐射事故时间不确定以及辐射损伤超过 48h 的患者更具有诊断意义。用代谢组学研究辐射代谢产物作为生物标志物中最为重要的一种，为辐射损伤的诊断、治疗提供了重要价值。1 1鼠的尿液辐射代谢谱的研究：鼠的尿液辐射代谢谱的研究：美国 Tyburski4等首先利用基于代谢组学的超高液相色谱飞行时间质谱联用技术(UPLCESIQTOFMS)，分析小鼠受y 射线照射 0、3 和 8Gy 后24h 的尿液，受照 3 和 8 Gy 的小鼠均产生了不同的尿液代谢表型，
11、说明受照后的尿液代谢谱发生了系统性变化，这一发现将有助于建立生物剂量计的模式或者群组。Lanz 等5利用较低分辨率的 GCMS 揭示受 1 射线照射 3Gy 后的 Wistar 大鼠尿液中潜在的生物标志物。除了发现一系列新的生物标志物，包括增加的 p 一甲酚、磷酸盐和减少的柠檬酸、a 一酮戊二酸、4 种二羧酸外，还发现大鼠尿液中源于胸苷和 2-脱氧尿嘧啶的胸腺嘧啶、尿嘧啶显著增加，这与之前检测到的小鼠结果相一致。不同种属间产生了类似的代谢表型，由此推测，人类在受照射后也会产生类似的代谢表型。2 2小鼠血清辐射代谢物谱的研究：小鼠血清辐射代谢物谱的研究：Khan5等通过 1HNMR 对 1 射线
12、照射后的小鼠血清进行代谢组学分析，发现代谢表型发生明显变化，并且与剂量和时间相关。在照射后 1d，8 Gy 照射组小鼠血清中的部分代谢物发生改变，如支链氨基酸、脂蛋白含量升高、葡萄糖含量下降。但是 3 和 5Gy 照射组小鼠血清中的代谢物并没有发生变化。在照射后 5d，所有照射组小鼠血清中的内源性代谢物均发生显著改变，包括乳酸盐、氨基酸类、内铵盐、磷酸氨基乙醇、胆碱含量增加，葡萄糖含量减少。这些变化可能与电离辐射诱导能量、脂质、蛋白质的代谢紊乱相关。根据这些代谢物的改变，可以把照射组与对照组区分开，这将有助于建立快速筛查受照射人群的模式，以便使受照者尽早接受治疗，提供了一种在相对短的时间内筛查
13、大量人群受照射情况的方法。3 3癌症患者血清代谢组研究：癌症患者血清代谢组研究：汪晋6等搜集 30 例乳腺癌患者和 25 例正常人的血清，衍生化后采用 GCMS 分析其氨基酸、脂肪酸、糖类、有机酸等内源性代谢物变化，乳腺癌患者血清中丙氨酸、草酸和谷氨酰胺的发生频率分别 96.7%、100和 93.3，这可能是潜在的代谢肿瘤标记物。乳腺癌患者血清丙氨酸、氨基丙二酸、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸浓度均显著性降低可能是肿瘤组织需要大量的氨基酸来完成其旺盛的蛋白质合成，同时生糖氨基酸和生酮氨基酸是能量代谢必需氨基酸，而肿瘤组织能量代谢强于正常组织，导致进入血液中的丙氨酸减少。深入研究还发现与正常人
14、比，乳腺癌患者血清亚油酸、反式油酸、硬脂酸均显著性降低，表明乳腺癌患者脂类代谢异常。研究结果有助于从小分子代谢物水平理解乳腺癌的发生机制，并可作为辅助手段应用于乳腺癌的诊断。三、展望三、展望综上所述，代谢组学是继基因组学、蛋白质组学、转录组学后出现的新兴“组学”,自1999 年以来，每年发表的代谢组学研究的文章数量都在不断增加。从表面上看，代谢组学的发展很迅速，但是仍然远远落后于基因组学和蛋白质组学。人们对代谢组学充满了期待：寻找一种新的生物标记物，发现一条新的代谢途径，或更深入的了解目前已知的这些途径。代谢组学研究最大的挑战就在于对代谢产物的识别，这也是最有趣的方面，而更具挑战性的工作，是进
15、一步确认所有代谢物的功能。代谢组学在放射医学研究领域尚处于起步阶段，在不同实验动物体内及临床肿瘤患者血清中已经发现了一些与放射应激反应相关的候选生物标志物(群)，这些标志物不同程度地表现出剂量-效应及时间一效应关系，在放射损伤诊断、分类及生物剂量估算等方面具有一定的应用潜势。相信随着其方法的不断完善和优化，代谢组学的研究对推动放射医学的发展，尤其对放射损伤的诊断将具有重要的意义和作用。参考文献 1刘海翔，王治东，陈英.代谢组学研究方法及其在放射医学领域的应用展望 .中华放射 医学与防护杂志，2012， 32（2）:2212AnnesleyT，Majzoub J，Hsing A，et a1Mas
16、s spectrometry in theclinical laboratory：how have we done，andwheredo we needto be?Clin Chem，2009，55(6)： 1236-123931ssaq HJ.Van QN，Waybrlght TJ，et a1Analytical and statistical approaches to metabolomies researchJ Sep Set，2009，32(13)：2183，21994Tyburski JB，Patterson AD，Kransz KW，et a1Radiation metabalnmies :identification of minimally invasive urine biomarkes for gamma-radiation exposure in miceRadint Res，2008，170(1)：1145Khan AR，Rana P
