《DNS-氨基酸的制备和鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNS-氨基酸的制备和鉴定（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 生命科学学院生命科学学院LifeLife ScienceScience CollegeCollege生生 物物 化化 学学 实验报告实验报告姓名：柳伟雄姓名：柳伟雄 班级班级：20132013级生科一班级生科一班 学号：学号：201300140062201300140062 同组者：曾玮璠同组者：曾玮璠山东大学实验报告山东大学实验报告 20152015 年年 3 3 月月 1818 日日姓名：姓名：柳伟雄柳伟雄 系年级：系年级：生科一班生科一班 20132013 级级 同组者：同组者：曾玮璠曾玮璠科目：科目：微生物实验微生物实验 题目：题目：DNS-氨基酸的制备和鉴定氨基酸的制备和鉴定 仪器
2、编号：仪器编号： 一、目的和要求一、目的和要求1. 了解并掌握 DNS-氨基酸的制备和鉴定的原理2. 掌握制备 Dansyl 氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法二、原理二、原理荧光试剂 5-二甲氨基-1-萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称 DNS-Cl)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的 氨基结合成带有荧光的 DNS-氨基酸(DNS-肽或 DNS-蛋白质)，DNS-氨基酸再经酸水解 可释放出 DNS-氨基酸 DNS-Cl 能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨 基酸可生成双 DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，
3、 灵敏度可达 1010109mol 水平，比茚三酮法高 10 倍以上，比过去常用的 FDNB 法高 100 倍。将 Edman 法和 DNS 法结合起来(称为 Edman-DNS 法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高 Edman 法的灵敏度及其分析速度。 DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为 0.01ug(相当于 10 10mol)。由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分 析。层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配 系数等） ，使各组分在两相（一相为固定的，称为
4、固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布 程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动 而达到分离的目的。聚酰胺是类化学纤维原料，由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶 66 。因为在这类物质分子中都含 有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一 CO 及NH 基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类如核苷酸、氨基酸等)是以其羟 基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢 键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺
5、表面竞相形成 氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异， 经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。山东大学实验报告山东大学实验报告 20152015 年年 3 3 月月 1818 日日姓名：姓名：柳伟雄柳伟雄 系年级：系年级：生科一班生科一班 20132013 级级 同组者：同组者：曾玮璠曾玮璠科目：科目：微生物实验微生物实验 题目：题目：DNS-氨基酸的制备和鉴定氨基酸的制备和鉴定 仪器编号：仪器编号： 三、试剂和器材三、试剂和器材1. 聚酰胺薄膜（77cm）2. 电吹风一个3. 紫外灯一台 4. 点样管（4 支） 5. 吸管 6.量筒烧杯（50
6、0ml） 8. 铅笔四、 实验试剂1. DNS-Cl 丙酮溶液2. 展层液： V(甲酸)：V(蒸馏水)=1.5:100 3. 氨基酸样品：标准 Gly、Phe、His 溶液 4. 混合氨基酸溶 液四、四、测定测定1. DNS 标记：取 4 个小离心管，分别加入氨基酸 30ul，再各加入 30ulDNS-Cl 丙酮溶液，混合均匀后置于 37水浴 中 1 小时；2. 点样：在距聚酰胺薄膜底端 0.5-1cm 处用铅笔画一条直线，以这条直线为基准，分别取四个离心管中液体用 四个不同的点样管在聚酰胺薄膜上点样，直径不宜超过 2mm， ，重复 2-3 次，最多不宜超过 5 次；3. 展层：1) 配制展层
7、液(V(甲酸)：V(蒸馏水)=1.5:100)100ml，可两个小组共同配制使用；2) 将展层液置于培养皿盖（加 12-13ml）或底（加 10ml）中，将已点样的聚酰胺薄膜用皮筋套上可使 其站立后放入展层液中，盖上 500ml 烧杯；山东大学实验报告山东大学实验报告 20152015 年年 3 3 月月 1818 日日姓名：姓名：柳伟雄柳伟雄 系年级：系年级：生科一班生科一班 20132013 级级 同组者：同组者：曾玮璠曾玮璠科目：科目：微生物实验微生物实验 题目：题目：DNS-氨基酸的制备和鉴定氨基酸的制备和鉴定 仪器编号：仪器编号： 3) 待展层液上升到距顶端大约 0.5cm 时展层结
8、束，将其取出，冷风吹干；4. 透射：将冷风吹干的聚酰胺薄膜放在紫外灯下，用铅笔将黄绿色斑点圈出。五、五、 实验结果实验结果注：X 为色斑中心至原点中心的距离，Y 为溶剂前缘至原点中心的距离,其中 Y 值均相同为5.20cm。在混合氨基酸中：1. 对于赖氨酸：X1=0.45cm ，X2=4.30cm 则 Rf1 =0.087，Rf2=0.8272. 对于丙氨酸：X3 =2.81cm 则 Rf3 =0.5403. 对于苯丙氨酸：X4 =1.20cm 则 Rf4=0.231各个标准氨基酸与混合氨基酸中的对应成分 Rf 值相同。六、六、 注意事项注意事项1. 严格控制点样位置以及点样直径，点样时直径不
9、宜超过 2mm，不宜点在边缘，点样后马上用吹风机 冷风吹干，重复 2-3 次以保证点样量足够，点样不能太用力，防止聚酰胺薄膜断裂而影响展层；2. 展层液要现配现用，需混合均匀，用量既不可不足，又不可过量而导致把点样点没过；3. 展层后必须经电吹风将膜吹干；4. 使用紫外照射时要注意使用时间短。七、七、 分析总结分析总结从实验结果分析可得以下几条结论：1. 由实验原理可知，氨基酸的氨基与 DNS-Cl 反应后是黄绿色荧光。而 Lys 含有两个氨基，因此 L ys 带有两个黄绿色荧光标记。又由于 DNS-Cl 主要与 -氨基反应，由此可判断最上方的少量黄绿色荧光 的是 Lys 的 -氨基反应后的
10、DNS-Lys。2. DNS-丙氨酸的相对分子质量体积最小,非极性最强，形成氢键最弱，展层速度最快，因而在最上方； 而 Lys 由于与聚酰胺表面形成 2 个氢键，极性强，所以展层速度慢；Phe 的极性处于两者之间，因而 展层速度也在两者之间。所以本实验的结果主要与氨基酸的极性和所形成的氢键有关。3. 聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随展层液通过聚酰胺薄膜时，由于被分离氨基酸与 薄膜形成氢键，而各氨基酸形成氢键的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力强,展层速度慢，吸附力 弱，展层速度快。导致所展示的层析结果。4. 展层液与被分离氨基酸在聚酰胺离子表面竞争形成氢键，展层液使被分离氨基酸在展
11、层液与聚酰胺 薄膜表面之间的分配系数有较大差异。易溶于展层剂的所受的动力作用大，展层速度快，反之，速度 慢。5. 从实验结果分析可得：混合氨基酸中应同时含有赖氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸三种。 实验中可导致 误差出现的几点：山东大学实验报告山东大学实验报告 20152015 年年 3 3 月月 1818 日日姓名：姓名：柳伟雄柳伟雄 系年级：系年级：生物科学生物科学 20132013 级级 同组者：同组者：曾玮璠曾玮璠科目：科目：微生物实验微生物实验 题目：题目：DNS-DNS-氨基酸的制备和鉴定氨基酸的制备和鉴定 仪器编号：仪器编号： 1. 在聚酰胺薄膜上点样时用力过大，很可能会使聚酰胺薄膜断裂，影响层析结果，可能会导致心形黄绿色荧光斑出现，我在点样时就出现这种情况，导致混合氨基酸的荧光斑的其中一个出现心形；2. 点样时不及时吹干，致使点样液扩散，会在很大程度上影响实验结果，因严格控制点样点的大小， 最好不要超过 2mm；还有点样时应重复 2-3 次，防止点样液成分不足；3. 点样时若两点之间间隔过小，也会影响实验结果，本次实验宜控制在 1cm 左右。
