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1、ICS 点击此处添加 ICS 号 点击此处添加中国标准文献分类号中华人民共和国 行业标准XX/T XXXXXXXXX饲料中转基因植物成份 PCR 检测方法PCR Protocol for Detection of Genetically Modified Plant Ingredients in Feed点击此处添加与国际标准一致性程度的标识送审稿XXXX - XX - XX 发布XXXX - XX - XX 实施发 布前 言本标准根据GB/T1.1-2009标准化工作导则中的要求进行编写。 本标准代替SN/T 1201-2003植物性饲料中转基因成分定性PCR检测方法 本标准与SN/T 12
2、01-2003相比，主要技术变化如下： -增加了植物的品种，由原标准的大豆、玉米和油菜扩展到水稻、棉花和小麦等； -增加了基因特异性筛查的范围，由原标准的6个外源基因扩展到12个外源基因； -增加了转基因品系鉴定的种类，由原标准的1个品系（抗农达转基因大豆RRS）增加到61个品 系； -原标准采用普通PCR方法，本标准全部采用实时荧光PCR方法，方法更灵敏，检测更快速。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：深圳出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：章桂明、凌杏园、潘广、向才玉、程颖慧、康林、余道坚、龙海、郑耘、陈 枝楠、杨伟东。 本标准中如涉及国内已申请的专利，专利
3、持有人声明放弃在中国境内的使用。饲料中转基因植物成份 PCR 检测方法1 范围本标准规定了饲料中转基因植物成份的定性实时荧光 PCR 检测方法。 本标准适用于饲料中大豆、玉米、水稻、油菜、棉花和小麦等转基因植物成份的定性检测和相关 品系的鉴定。 本标准同样适用于玉米酒糟粕转基因成份的定性检测和相关品系的鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 G
4、B/T 19495.7 转基因产品检测抽样和制样方法 SN/T 0798 进出口粮油、饲料检验 检验名词术语 SN/T 1193 基因分析检测实验室技术要求3 术语、定义和缩略语下列术语和定义适用于本标准。3.1 术语和定义3.1.1 饲料（Feed） 饲料，是所有人饲养的动物的食物的总称，比较狭义地一般饲料主要指的是农业或牧业饲养的动 物的食物。3.1.2 实时荧光 PCR（real-time fluorescent polymerase chain reaction）实时荧光聚合酶链式反应是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监 测整个PCR进程，荧光信号的强弱直接反
5、映模板数量。3.2 缩略语Acp1 (Acid phosphatase 1)：酸性磷酸酶 1 基因。 BAR（phosphinothricin acetyltransferase gene）：磷化麦黄酮乙酰转移酶基因。 BnACCg8 (acetyl-CoA carboxylase gene)：油菜乙酰辅酶 A 羧化酶基因。 bp（base pair）：碱基对。 Btc（the construct specific DNA sequence of transgenic rice TT51-1 and Bt shanyou 63）：转基因水 稻品系 TT51-1 和 Bt 汕优 63 结构特异性
6、基因序列。 CaMV35S（35S promoter from cauliflower mosaic virus）：来自于花椰菜花叶病毒的 35S 启动子。CP4-EPSPS（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene）： 5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因。 CryIA(b) a synthetic gene encoded the first 648 amino acids, insecticidal-active truncated product identical to that of CryIA(b) gene of Bacillu
7、s thuringiensis subsp, Kurstaki steain HD-1：苏云金芽孢杆菌结 晶蛋白(Cry)I 型毒素抗虫基因。 CryIA(c) a synthetic gene encoded the 29 to 613 amino acids, insecticidal-active truncated product identical to that of CryIA(c) gene of Bacillus thuringiensis ：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 cryIA(c)基因。 CryIA（b)/CryIA(c)：苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白 cry1A(b)和 cr
8、yA(c)融合基因。 Ct 值 （C：Cycle，t：threshold）：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。CTAB（cetyltrithylammonium bromide）：十六烷基三甲基溴化铵。 dATP（deoxyadenosine triphosphate）：脱氧腺苷三磷酸。 dCTP（deoxycytidine triphosphate）：脱氧胞苷三磷酸。 dGTP（deoxyguanosine triphosphate）：脱氧鸟苷三磷酸。 DNA（deoxyribonucleic acid）：脱氧核糖核酸。 dNTP（deoxyribonucleoside
9、triphosphate）：脱氧核苷三磷酸。 dUTP（deoxyuridine triphosphate）：脱氧尿苷三磷酸。 EDTA（ethylene diaminetetraacetic acid）：乙二胺四乙酸。 FMV35S（35S promoter from a modified figwort mosaic virus)：玄参花叶病毒的 35S 启动子。 Gos9：一种水稻根部表达蛋白基因。 GOX（glyphosate oxidoreductase gene）：草甘磷氧化还原酶基因。 GUS（beta-D-glucuronidase gene）：-D-葡萄糖醛酸酶基因。 NOS
10、（terminator of nopaline synthase gene）：胭脂碱合酶基因终止子。NPT（neomycin-3-phosphotransferase gene）：新霉素-3-磷酸转移酶基因。 PAT（phosphinothricin acetyltransferase gene from Bacillus amyloliquefaciens ）：来源于杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 草丁磷乙酰转移酶基因。 PCR（polymerase chain reaction）：简称 PCR。 PE3-PEPcase (phosphoenolpyruvate-
11、Carboxylase)：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。 PLD (phospholipdase D)：磷脂酶 D 基因 Taq酶：源于水生栖热菌的耐热DNA 聚合酶。 TE：Tris-HCl、EDTA 缓冲液。 TM（melting temperature）：熔解温度。 Tris tris (hydroxymethyl) aminomethane ：三（羟甲基）氨基甲烷。 UNG酶(uracil-N-glycosylase): 尿嘧啶-N- 糖基化酶(UNG)酶。 Zein ：玉米醇溶性蛋白基因。zSSb：玉米淀粉合酶异构体zSTSII-2基因。 Wx012: 小麦蜡质基因。4 原理实时荧光定量P
12、CR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标 记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基因发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR扩增时，Taq酶的5端-3端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号 的积累与PCR产物形成完全同步。5 主要设备和试剂5.1 主要设备实时荧光 PCR 仪、制冰机、
13、核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计、恒温水浴锅、离心机、研钵及粉 碎装置、涡旋震荡器、微量移液器（2.5 L, 20 L, 200 L, 1000 L）。5.2 主要试剂除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。实验用水应 符合GB/T 6682 中一级水的规格，所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.2.1 CTAB 提取液：20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCL，0.1 mol/L Tris-HCL，0.02mol/L Na2-EDTA , pH8.0。5.2.2 CTAB 沉淀液：5 g/L CTAB, 40 mmol/L NaCl。5
14、.2.3 蛋白酶 K 溶液：（20 mg/mL)。5.2.4 RNase A：（100mg/ml）。5.2.5 NaCl 溶液：（1.2 mol/L）。5.2.6 三氯甲烷（氯仿）：（氯仿：异戊醇：24：1）。5.2.7 异丙醇。5.2.8 70%无水乙醇。5.2.9 TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。5.2.10 实时荧光 PCR 反应混合液：12.5 L 反应体系包括：1-2U 的 Taq 酶、2PCR buffer、2.5- 4.0 mmol/L 的 Mg2+、0.2-1 U 的 UNG 酶、0.2 mmol/
15、L 的 d(A,C,G)TPs、0.2-0.4 mmol/L 的 dUTP、400 nmol/L 的 ROX 染料（某些荧光 PCR 仪不需要 ROX 校正）。如有等效的商品化试剂盒，则可使用这些等 效产品。5.2.11 引物和探针：用于实时荧光 PCR 检测的引物和 TaqMan 探针见表 1。表 1 用于实时荧光 PCR 方法检测的引物和探针检测基因 和品系引物序列（5-3）探针序列（5-3）备注18S rRNA正：cctgagaaacggctaccat 反：cgtgtcaggattgggtaatFAM-tgcgcgcctgctgccttcct- TAMRA真核生物内源基因tRNALeu正
16、：cgaaatcggtagacgctacg 反：ttccattgagtctctgcacctFAM-gcaatcctgagccaaatcc- TAMRA高等植物内源基因Lectin正：cctcctcgggaaagttacaaFAM-大豆内源基因反：gggcatagaaggtgaagttccctcgtctcttggtcgcgccctct- TAMRAGos9正：ttagcctcccgctgcaga 反：agagtccacaagtgctcccgFAM- cggcagtgtggttggtttcttcgg- TAMRA水稻内源基因PLD正：tggtgagcgttttgcagtct 反：ctgatccactagcaggaggtccFAM- tgttgtgctgccaatgtggcctg- TAMRA水稻内源基因BnACCg8正：ggtgagctgtataatcgagcg 反：ggcgcagcatcggctFAM- aacacctattagacattcgttccattggtc ga-TAMRA油
