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1、1慢病毒绿色荧光蛋白感染人胰腺癌细胞 株 CFPAC-1 的效率观察【摘要】 目的：观察慢病毒-绿色荧光蛋白（Lentivirus-green fluorescent proteins，慢病毒-GFP）感染人胰腺癌细胞株 CFPAC-1 的效率，为后继的利用慢病毒载体来介导 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）实验作准备。方法：应用慢病毒-GFP 感染CFPAC-1 细胞，在感染后不同的时间段在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP 的表达情况并计算感染效率。结果：慢病毒-GFP 感染 CFPAC-1 细胞从 6072小时开始可见明显的绿色荧光，在感染复数（multipl
2、icity of infection, MOI）=10 时，CFPAC-1 细胞的慢病毒感染效率在 60 小时左右可达 80以上，72 小时7 天基本能够达到 90的感染效率，在此后 4 周内作连续观察，感染效率仍维持在8090。结论：慢病毒可稳定感染人胰腺癌细胞株 CFPAC-1，且效率高，可作为载体对该细胞株进行 RNAi 实验。 【关键词】 慢病毒；胰腺癌细胞，CFPAC-1；绿色荧光蛋白Abstract Objective：To observe the infection efficiency on CFPAC-1, one cell line of human pancreatic
3、cancer, after application of the lentivirus-GFP. Then making preparations for the following experiments about RNA Interference（RNAi）. Methods：Application the lentivirus-GFP infection CFPAC-1, at different periods after infection, we observed the expression of green fluorescent proteins(GFP) and then
4、 calculated the infection efficiency. Results：In the period of 6072 h after lentivirus- GFP infection CFPAC-1, we observed conspicuous green fluorescence. When the multiplicity of infection(MOI) was 10, the infection efficiency of lentivirus-GFP was above 80 after infection 60 h around; In the perio
5、d of 72 h7 d, the infection efficiency basicly meeted 90. After following 4 weeks continuous observation, we found the infection efficiency still keeping in the range of 8090. Conclusions：Lentivirus can steadily infect CFPAC-1 and the infection efficiency is considerable high, we can use it as the v
6、ector to do some RNAi experiments on the cell line of CFPAC-1.2Key words Lentivirus; Pancreatic cancer cell; CFPAC-1; Green fluorescent protein我们既往研究表明，人胰腺癌细胞株 CFPAC-1 高表达增殖诱导配体（APRIL）基因1，我们欲进一步采用 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）试验来研究该基因在胰腺癌的发生、发展中的内在机制。然而, 未见国内外有关 CFPAC-1 细胞株转染效率的报道。因此，我们先预实验观察慢病毒-绿色荧
7、光蛋白（Lentivirus-green fluorescent proteins，慢病毒-GFP）感染人胰腺癌细胞株 CFPAC-1 的效率，为后继的利用慢病毒载体进行 RNAi 实验奠定基础。1 材料和方法11 材料 人胰腺癌细胞株 CFPAC-1（中科院上海生科院细胞资源中心）；慢病毒-GFP、293T 细胞株、HBSS (Hanks balanced salts solution) 液（上海吉凯公司）；RPMI-1640 培养基（美国 Invitrogen 公司）；胎牛血清（Hyclone 公司）；DMI 4000B倒置荧光显微镜（Leica 公司）。12 细胞培养 分别用含 10胎牛
8、血清的完全培养基单层培养 CFPAC-1、293T细胞于 37、5CO2 饱和湿度恒温孵育箱内，以 0.25胰酶消化传代。13 慢病毒感染 CFPAC-1 及 293T 细胞 实验前 1 天接种 1105 个 CFPAC-1及 293T（对照细胞）于 24 孔培养板中，所加完培体积为 400 l，待细胞融合约5060时进行病毒感染。取-70保存的病毒在冰上融化，无菌操作，在目的细胞和对照细胞中分别加入 50 l HBSS 液稀释好的病毒，培养液总体积为 500 l,混匀后置 37培养。如慢病毒对细胞有明显毒性作用，在感染 812 小时后，更换新鲜完培（800 l/well）后继续培养；如慢病毒
9、对细胞没有明显毒性作用，46 小时后可补加入 300 l 完培继续培养。由于病毒载体上带有 GFP 绿色荧光蛋白，可以3在病毒感染 4872 小时及随后 4 周用倒置荧光显微镜观察 GFP 绿色荧光，以观察病毒对目的细胞的感染情况。14 确定最适的感染复数（multiplicity of infection, MOI）值 将生长状态良好的CFPAC-1 及 293T 细胞接种到 96 孔板, 每孔中加 1105 个细胞, 按病毒与细胞的比例(MOI 值=1、5、10、50 和 100)进行实验, 培养 8 h 后, 更换 10%血清的培养液继续培养, 加入病毒 34 天后通过荧光显微镜观察阳性
10、细胞比例，计算细胞感染效率在 80%以上时需要的病毒量来确定最适感染 MOI 值。 2 结 果慢病毒-GFP 感染 CFPAC-1 及 293T 细胞效率观察：慢病毒-GFP 感染 CFPAC-1细胞从 6072 小时开始可见明显的绿色荧光，在 MOI（感染复数）=10 时，CFPAC-1 细胞的慢病毒感染效率（GFP 阳性率）在 60 小时达 80以上，72 小时7 天基本能够达到 90，在此后的 4 周内作连续观察，荧光细胞数并未下降，感染效率仍维持在 8090。经同样处理的 293T 对照细胞在 MOI5 时各时间段的感染效率也在 80左右，见图 1。由图可知，慢病毒感染 CFPAC-1
11、 细胞效率高，且能长期稳定感染。3 讨 论目前，质粒载体介导的 RNAi 试验已广泛应用于生命科学相关研究领域，由于无法保证高基因转染效率，故稳定转染细胞株的筛选也变得很不确定，尤其是那些转染效率极低的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，即使采用抗性筛选也异常艰难，这个瓶颈极大的限制了 RNAi 相关的研究。而慢病毒属逆转录病毒家族, 为非致癌性病毒，常作为基因治疗载体。其特点是4能感染非分裂期细胞和分裂期细胞, 为潜伏期长、持续时间长的慢性感染2。现阶段慢病毒表达系统包括 3 个主要部分：慢病毒表达载体、慢病毒包装质粒、产生假病毒颗粒的细胞株（如 293T 细胞）；即该系统中包括包装、
12、转染、稳定整合到基因组 DNA 和表达 siRNA、cDNA 或报告基因等过程所需要的遗传信息。对于多种细胞，通过慢病毒介导的方法可实现几乎 100的转染效率，稳定转染细胞株筛选的成功性也大大增加3,4。利用慢病毒构建的短发夹 RNA（small hairpin RNA, shRNA）载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的 shRNA 相比， lentivirus-shRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，且在感染后可整合到受感染细胞基因组，进行长时间的稳定表达。尤其是慢病毒感染用于活体实验时
13、，并不会像其他化学转染一样引起非特异性反应，因而适用于在体 RNAi 的研究，包括稳定表达细胞株成瘤实验、瘤内注射、局部注射等, 这就为在患者体细胞中实现针对致病基因的 RNAi 提供了可能57。【参考文献】1 邵建国,毛振彪,谭 畅,等. 消化系肿瘤增殖诱导配体高表达细胞株的筛选J. 胰腺病学, 2006, 6（5）: 289-291.2 Romano G. Current development of lentiviral-mediated gene transferJ. Drug News Perspect, 2005, 18（2）: 128-134.3 Lois C, Refaeli
14、Y, Qin XF, et al. Retroviruses as tools to study the immune system J. Curr Opin Immunol, 2001, 13（4）: 496-504.4 Abbas-Terki T, Blanco-Bose W, Deglon N, et al. Lentiviral-mediated RNA interferenceJ. Hum Gene Ther, 2002, 13(18): 2197-2201.5 Fish RJ, Kruithof EK. Short-term cytotoxic effects and long-t
15、erm instability of 5RNAi delivered using lentiviral vectorsJ. BMC Mol Biol, 2004, 5(9):1-15. 6 An DS, Xie Y, Mao SH, et al. Efficient lentiviral vectors for short hairpin RNA delivery into human cellsJ. Hum Gene Ther, 2003, 14（12）: 1207-1212. 7 Scherr M, Battmer K, Ganser A, et al. Modulation of gene
