《Wnt信号途径在胃癌组织和细胞系中的活化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Wnt信号途径在胃癌组织和细胞系中的活化（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1Wnt 信号途径在胃癌组织和细胞系中的 活化作者：韩竞春，黄磊，张开立，陈晓燕，孔庆友，孙媛，吴茉莉，李宏 【摘要】 目的 研究 Wnt 通路在胃癌组织中的活化状态及其与胃癌发生发展的关系。方法 应用免疫组化、免疫荧光、RT PCR 和 Western 蛋白印迹等方法，在胃癌组织和细胞系中检测 Wnt 信号途径的活化状态。结果 Wnt 2、 catenin 和TCF4 在胃癌组织中的表达明显高于癌前病变组织（P0.01）；Wnt 组与 Wnt-组中癌前组织和胃癌组织的分布具有显著统计学差异（P0.001）。结论 Wnt 信号通路在胃癌组织中呈活化状态，并与胃癌发生发展密切相关。 【关键词】
2、胃肿瘤；Wnt；信号传导Abstract： Objective To illustrate the activation status of Wnt signaling and its correlation with gastric carcinogenesis. Methods Immunohistochemistry, immunofluorescence, RT PCR and western blotting were adopted to detect Wnt signaling activation in the gastric cancer tissues and cell l
3、ines.Results Expressions of Wnt2, catenin and TCF4 were significantly higher in the cancer tissues, compared with premalignant tissues (P0.01). The distributions of Wnt+ and Wnt-groups were significantly different in premalignant and cancerous tissues (P0.001). Conclusion Wnt signaling is not only a
4、ctivated in gastric cancer tissues but associated with gastric carcinogenesis as well.Key words： gastric neoplasm; Wnt; signaling胃癌是我国乃至全球范围内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一。大连医科大学辽宁省癌症基因组学重点实验室与澳大利亚墨尔本大学癌症研究中心合作，利用基因芯片杂交技术1，对胃癌及其相关性病变的基因表达谱进行研究发现，在胃癌的发展过程中出现了 Wnt 信号的异常，包括 Wnt 表达的频率上调2，以2及 TCF4 和 catenin 的核易位3。本研究针
5、对胃癌组织中 Wnt 传导通路关键基因及总体水平的活化状态进行探讨。1 材料与方法1.1 材料 （1）标本来源和细胞系来源：54 例胃癌及癌旁组织均选自大连医科大学辽宁省癌症基因组学重点实验室建立的人胃癌组织库。胃癌细胞系 AGS 和HGC 27 购于美国 ATCC（American Type Cell Culture）细胞库。MGC803（人胃低分化黏液癌）和 BGC823（人胃低分化癌）从北京肿瘤研究所购进。 （2）抗体：羊多克隆 Wnt 2 抗体，鼠单克隆 catenin 抗体，兔多克隆 TCF4 抗体，免疫荧光羊抗鼠抗体，免疫荧光羊抗兔抗体均为 Santa Cruz（Santa Cru
6、z，CA，USA）公司产品。1.2 方法 （1）石蜡组织微阵列的制作：石蜡组织微阵列采用自制的阵列制作仪制作。 （2）免疫组化染色：免疫组化试剂盒：HistostainTM plus Kits SP 9003(山羊SP Kit)、SP 9000（通用 SP Kit）购自北京中山生物技术有限公司；按照 SP 试剂盒说明进行免疫组化染色。结果的判定按参考文献4。 （3）细胞培养：MGC803 和BGC823 细胞培养液：DMEM 培养基，10%胎牛血清。AGS 及 HGC 27 细胞培养液：Hams F 12 培养液， 10%胎牛血清， 根据美国 ATCC 推荐56。在细胞培养箱中培养细胞至 80
7、%汇合时收集细胞，提取 RNA 和蛋白用于实验分析。 （4）RNA 提取和 RT PCR 分析：常规 Trizol 法提取总 RNA。反转录体系依照 TaKaRa RNA LA PCRTM Kit 试剂盒提供说明书进行操作，PCR 引物序列（TaKaRa 生物工程有限公司）见参考文献710。 （5）胃癌细胞系总蛋白的提取及 Western 印迹分析：常规提取细胞总蛋白。Western 印迹分析参照文献11方法进行。 （6）免疫荧光：预先在培养皿底铺数张已灭菌的盖玻片（约 5 mm5 mm），把细胞接种于皿中，等3细胞均匀生长在皿底和盖玻片上时，取出盖玻片，100%冷丙酮-20 固定，用于免疫荧
8、光分析。 catenin 和 TCF4 在细胞系中表达采用双色荧光标记法。1.3 统计学方法 使用 SPSS12.0 版本统计软件，选用 Kruskal Wallis 检验方法。2 结果2.1 Wnt 2、 catenin 和 TCF4 在不同病变胃组织中的表达 见表 1，图 1A。表 1 Wnt 2、 catenin 和 TCF4 在不同病变胃组织中的表达（略）与癌前病变组比较，P0.01图 1 Wnt 途径在胃癌组织中的免疫组化（A）和细胞系免疫荧光（B）（略）2.1.1 Wnt 2 在胃癌组织中表达率为 90.3%（28/31），多呈现为强染色（17 例），明显高于癌前病变组织，统计学比
9、较差异显著（P0.01）；而且 Wnt 2 在两种类型胃癌中表达频率均较高，两组间无统计学意义（P0.05）。2.1.2 catenin 的核易位表达在癌前和胃癌两组间比较统计学差异显著（P0.01）。在两种类型胃癌组织中的表达无统计学意义（P0.05）。2.1.3 在全部 31 例胃癌组织中均可见 TCF4 的表达，而且均为强阳性染色。TCF4 在癌前病变和胃癌组织间的表达统计学差异显著（P0.01）。2.2 Wnt 通路在不同胃组织中的分布 Wnt 途径活化（Wnt+）是指同一样本中Wnt 2 和 catenin /TCF4 同时呈现阳性表达；而在同一样本中上述三个关键环节4不能同时表达，
10、则视为 Wnt 途径处于非活化状态（Wnt-）。在实验研究中，将全部54 个样本按照上述原则分为 Wnt 组和 Wnt-组，探讨它们在不同病变胃组织中的分布。54 例样本中，29 例存在 Wnt 通路活化（Wnt 组），其中 27 例（93.1%）为胃癌组织，癌前病变组织仅有 2 例（6.9%）；25 例 Wnt 通路非活化组（Wnt-组）中，21 例为癌前病变组织（84.0%），而仅有 4 例（16.0%）为胃癌组织。在 Wnt 组与 Wnt-组中癌前组织和胃癌组织的分布具有显著统计学差异（P0.001）。 2.3 胃癌细胞系中 Wnt 信号途径活化 免疫荧光结果显示 catenin /TC
11、F4 的核易位出现在MGC803 和 BGC823 细胞系中（见图 1B）。RT PCR 和 Western 蛋白印迹结果Wnt 2、 catenin 和 TCF4 在四个胃癌细胞系中的表达情况见图 2。图 2 胃癌细胞系中的 Wnt 通路 RT PCR 和 Western blotting 结果（略）3 讨论Wnt 信号通路不仅对正常胚胎发育起着重要作用，而且 Wnt 信号通路的不恰当激活将导致细胞恶性转变和肿瘤发生1213。在 Wnt 途径中，Wnt 信号和 catenin/TCF 复合体被认为是 Wnt 信号途径活化的关键因子。Wnt 家族有 19 个成员，胃癌中以 Wnt 2 的表达更
12、为常见8。就胃癌而言，目前现有的研究多着眼于 Wnt 途径中 Wnt 2，或 catenin，或 TCF4 等几个关键环节，并以其中某个环节的改变来代表整条 Wnt 途径的活化，而针对 Wnt 传导通路总体水平的活化状态与胃癌及靶基因表达相互关系的研究尚未见报道。本实验首先应用本研究所自制的石蜡组织微阵列芯片和免疫组化染色方法，同时检测 Wnt 2、 catenin 和 TCF4 在不同病变胃组织的表达情况。结果显示，与癌前病变组织相比，Wnt 途径的关键因子 Wnt 2， catenin 和 TCF4 在胃癌组织5中均呈高表达状态，表明这些 Wnt 途径的关键因子的表达与胃癌的发生发展关系密
13、切。在胃癌组织中 Wnt 通路多呈活化状态；在癌前病变组织中，虽然存在 Wnt途径的部分因子的表达（即表现为或 Wnt 2 或 catenin/TCF4 的表达，而不存在同时表达），但在这些组织中却几乎没有激活的 Wnt 通路。这也证明了 Wnt 信号通路的激活与胃癌密切相关，可能在胃癌的发生发展中起重要作用；而利用胃癌细胞系的研究也发现了存在 Wnt 信号通路的活化。因此，Wnt 信号通路的活化可能是导致胃癌组织中相关基因表达的重要因素。2007 年 2 月 第 36 卷 第 1 期临 床 军 医 杂 志 (Clin J Med Offic)当然，Wnt 信号通路活化将导致其下游靶基因状态的
14、改变，但目前对 Wnt 传导通路的活化状态与下游各基因表达相互关系尚缺乏系统的分析，需要更为直接的证据去证实 Wnt 活化与胃癌发生发展的关系，而四个胃癌细胞系为我们提供了理想的体外实验模型。【参考文献】 1 Boussioutas A, Li H,Liu J,et al. Distinctive patterns of gene expression in premalignant gastric mucosa and gastric cancerJ. Cancer Res, 2003, 63:2569-2577. 2 Cheng X X,Wang Z C,Chen X Y,et al. C
15、orrelation of wnt 2 expression and beta catenin intracellular accumulation in chinese gastric cancers: Relevance with tumour disseminationJ. Cancer Lett, 2005, 223:339-347. 3 Cheng X X,Sun Y,Chen X Y,et al. Frequent translocalization of beta catenin in gastric cancers and its relevance to tumor prog
16、ressionJ. Oncol Rep, 2004, 11:1201- 1207. 4 Wang Q,Liu J,Wang X W,et al. Resveratrol promotes didderntiation and induces Fas independent apoptosis of medulloblastoma cellsJ. Neurosci Lett, 2003, 351: 83-86. 5 Choi J H,Ahn M J.Phospho Stat3 expression and correlation with VEGF, p53, and Bcl 2 in gastric carcinoma using tissue microarray J. APMIS, 2006, 114:619-6625. 6 Kanda N,Seno H.STAT3 is constituti
