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1、1利用 siRNA 抑制环氧合酶2 对人胃癌 裸鼠移植瘤的影响作者：黄国民 林瑞新 房学东 刘斌【摘要】 目的 观察环氧合酶 2（COX 2）对人胃癌裸鼠移植瘤的影响并探讨其机制。方法 构建靶向 COX 2 表达质粒和在 BALB/c 裸鼠皮下建立 SGC 7901 人胃癌细胞动物模型，用 COX 2 表达质粒基因转染治疗。结果 构建的 COX 2 表达质粒在体内、外均可稳定表达。COX 2 基因治疗可抑制裸鼠皮下肿瘤的生长和淋巴管的生成。COX 2 基因转染下调血管内皮生长因子 C（VEGF C）的表达。结论 通过构建靶向 COX 2 siRNA 真核表达载体可抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长和淋
2、巴管生成，COX 2 对抑制胃癌细胞（SGC 7901）治疗有确切效果。 【关键词】 胃肿瘤;环氧合酶 2;基因治疗目前对于胃癌的治疗效果仍不理想，作为中晚胃癌主要治疗手段的化疗和放疗，在杀灭肿瘤细胞的同时，也损伤正常的组织细胞，疗效低、毒副作用大。有研究表明环氧合酶 2（COX 2）在多种肿瘤中呈高表达，并可能在肿瘤的发生、发展过程中起到重要的作用1，2。但由于 COX 2 抑制剂尚存在特异性和抑制效率等方面的不足，因此需要研究如何提高 COX 2 治疗的敏感性。本研究希望通过构建表达靶向 COX 2 的短发夹状双链 RNA（shRNA）的表达质粒，转染人胃癌细胞系SGC 7901，探讨其抑
3、制肿瘤细胞生长的机制及对淋巴管生成的影响。1 材料与方法1.1 动物及试剂2BALB/c 裸鼠，4 w 龄，雄性，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。置于SPF 级无菌饲养室，恒温，恒湿，半屏障系统下饲养。中分化人胃癌细胞系SGC 7901 购于中科院上海生物研究所，COX 2 羊抗人多克隆一抗购于 Santa Cruz 公司，羊抗人血管内皮生长因子（VEGF） C 单克隆抗体、血管内皮生长因子受体（VEGFR） 3 单克隆抗体购于武汉博士德生物技术开发公司，GENE GENIUS 凝胶图像分析仪购于英国 Syngene 公司。1.2 COX 2 表达载体的构建全长小鼠 COX 2 的 cD
4、NA 来自 COX 2 质粒，被克隆至 pGenesil 1 构建COX 2 表达载体（pGenesil 1 COX 2）。DNA 序列分析证实基因序列嵌入适当的读码框内，无突变。由上海博亚生物技术有限公司合成。1.3 RT PCR 检测 SGC 7901 细胞 COX 2 mRNA 表达根据 GenBank 公布的 COX 2 cDNA 序列，利用 primer 5 软件设计引物。以 actin 为内参照。由上海博亚生物技术有限公司合成。COX 2 引物:上游:5 TCAAGTCCCTGAGCATCIAC 3，下游:5 CATTCCTACCACCAGCAACC 3。目的片段长度 488 bp
5、。 actin 引物:上游:5 GAAACTACCTTCAACTCCATC 3，下游:5 CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC 3，目的片段长度 219 bP。PCR 产物行 2%琼脂糖凝胶电泳嗅化乙锭染色，紫外灯下检查，计算机扫描电泳图像，测出各条带的灰度值。1.4 动物模型及分组3实验动物分为 3 组，每组 5 只，分别为:接种 pGenesil 1 COX 2 siRNA 质粒组、接种 pGenesil 1 cotrol siRNA 质粒对照组、接种 SGC 7901 组。计数为1107 的细胞接种于裸鼠右前肢腋下，3 组细胞接种裸鼠后第 4 天可见肿瘤长出，每隔 4 d 测量 1
6、 次裸鼠最长径 a 值和最短径 b 值，4 w 后处死，计算肿瘤体积，公式为:肿瘤体积(V)=1/2最大直径最小直径 2。肿瘤体积抑制率=(1-干预组肿瘤体积/空白对照组肿瘤体积)100%。共测量 7 次。1.5 裸鼠肿瘤组织免疫组化染色判断标准COX 2、VEGF C 阳性细胞为细胞质染色呈棕或棕褐黄色，计算每例切片 5个高倍视野中阳性染色反应细胞的百分率，10%判定为阴性（-），10%判定为阳性（+）。VEGFR 3 染色呈棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇均计为 1 个微淋巴管（MLV），每例首先在低倍镜下选择微淋巴管密度(MLVD)最高的肿瘤区域，在 200 倍光镜下，随机计数 5 个视
7、野内 MLV，再求其平均值。通过 MLV 计数反映 VEGFR 3 水平。1.6 RT PCR 检测肿瘤组织 COX 2 mRNA 水平采用 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂提取肿瘤组织的总 RNA,Toyobo 公司的RT PCR 一步法试剂盒。COX 2 引物，上游：5 GTCAAAACCGAGGTGTATGT 3；下游：5 AAGTTGGTGGACTGTCAATC 3；扩增产物长度为 270 bp。扩增产物 1%琼脂糖凝胶电泳 30 min，EB 染色，用 BIO RAD 分析仪上观察并记录结果。1.7 统计学处理4所有实验数据取 xs，采用单向方差分析(0ne Way
8、ANONA)。采用 SPSS13.0软件进行处理。2 结 果2.1 肿瘤体积及体积抑制率干扰组、SGC 7901 组、阴性对照组肿瘤体积依次为(3.110.53、6.582.01、6.761.98)cm3，干扰组与 SGC 7901 组、阴性对照组之间有显著性差异(P0.05)；SGC 7901 组与阴性对照组之间无显著性差异(P0.05)，干扰组肿瘤体积抑制率为 55%，干扰组对肿瘤生长明显抑制(P0.05)。2.2 基因转染 COX 2 在 SGC 7901 成瘤组织中的表达COX 2 蛋白主要为细胞浆表达，阳性染色主要为细胞浆呈棕褐色。SGC 7901 组镜下约 70%80%的面积为阳性
9、染色。阴性对照组也表现为强阳性，而干扰组 COX 2 蛋白为弱阳性表达。 2.3 基因转染 COX 2 抑制 VEGF C基因表达减少，SGC 7901 成瘤组织中淋巴管的减少 光镜下可见肿瘤组织中的 MLV 呈棕色，为单个或成簇的细胞，可有或无管腔。MLV 大多集中在肿瘤边缘，肿瘤中心 MLVD 较肿瘤边缘相对减少。干扰组MLVD 为 8.423.3，对照组为 18.347.1，SGC 7901 组为 19.16.0，转染了干扰载体的肿瘤和未转染组之间有显著性差异（P0.05）。2.4 半定量 RT PCR 检测 COX 2 mRNA 表达5以琼脂糖电泳条带的亮度判断 COX 2 mRNA
10、表达高低。实验结果显示，与生理盐水处理组 COX 2 mRNA 表达相比，pGenesil 1 cotrol siRNA 处理组COX 2 mRNA 几乎无改变，而 pGenesil 1 COX 2 siRNA 质粒处理组COX 2 mRNA 表达明显下调，经软件分析,mRNA 下调 72.15%。3 讨 论淋巴转移是胃癌最主要的转移途径，早期胃癌即可出现淋巴转移，进展期胃癌淋巴转移高达 70%以上，是影响手术效果及预后的一个主要因素。由于缺乏明确的淋巴管生成因子和标记因子，且过去一直强调血管生成在肿瘤转移中的重要性，使得淋巴转移的研究进展缓慢，至今胃癌淋巴道转移的机制尚不清楚。有研究发现，在
11、发生淋巴结转移的肿瘤基质中，常有淋巴管的增生和扩张，并相继发现了一些特异作用于淋巴管内皮的生长因子及受体，为研究淋巴转移开辟了新的途径。VEGF C 属于血管内皮生长因子家族，又称淋巴管内皮生长因子，被认为与肿瘤、创伤等病理过程中的淋巴管生成有关。研究显示，人类多种肿瘤细胞的胞浆中都表达 VEGF C，并且其表达水平与肿瘤毛细淋巴管的密度、淋巴管生成及淋巴结转移密切相关35。VEGF C 受体之一的 VEGFR 3 特异性地表达于淋巴管内皮细胞上，与淋巴系统的发生和发育有关，是成熟淋巴管内皮细胞的特异性标记物。VEGF C/VEGFR 3 调控系统可能通过介导淋巴管内皮细胞的趋化性、细胞增殖和
12、淋巴管的增生、扩张，诱导新生淋巴管与已存淋巴管而影响淋巴管的数目、大小或改变现有淋巴管功能特性，使肿瘤细胞向淋巴管内渗透、转移，进入淋巴结，发生淋巴结转移。因此，阻断 VEGF C/VEGFR 3 信号转导途径可能成为抗肿瘤淋巴转移的有效手段6，7。6COX 2 属诱导型酶，在正常组织中无表达，当细胞受到各种刺激因素作用时COX 2 表达迅速上调。COX 2 不仅是启动炎症反应的关键酶，还可以通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、促进肿瘤新生血管形成等机制参与肿瘤的发生与发展过程。本课题组前期研究表明：COX 2 可能通过上调 VEGF C 的表达，促进胃癌的淋巴管形成和淋巴结转移，并影响胃癌患者的
13、预后6，7。RNA 干扰技术已成为分子生物学研究中最为活跃的热点之一，并作为一种新的工具用于肿瘤的治疗研究。大量实验研究表明，利用 siRNA 干涉技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这些基因保持在静寂或休眠状态，可能达到抗肿瘤作用。本研究采用皮下接种的方法将 SGC 7901 细胞及转染质粒的干扰组和阴性对照组细胞阳性克隆接种于裸鼠皮下，成功构建了裸鼠皮下移植瘤模型，以研究 COX 2 特异性 siRNA 在动物体内的抗肿瘤作用。本研究的移植瘤模型建立过程中，干扰组肿瘤小于阴性组及对照组，抑瘤率 55%，统计学结果显示三组裸鼠成瘤体积有显著性差异。免疫组化结果显示：干扰组
14、COX 2、VEGF C 的表达明显低于阴性对照组和 SGC 7901 组，MLVD 也明显低于其他两组，具有统计学意义。淋巴管一般位于肿瘤边缘，管腔扩张，肿瘤内部多为闭塞的管腔，推测 VEGF C 的过度表达增加了肿瘤内部及肿瘤边缘淋巴管的表面积，肿瘤内部为无功能的淋巴管，肿瘤周边存在有功能淋巴管，并足以使肿瘤细胞发生淋巴转移，而小分子 RNA 干扰抑制了肿瘤细胞 VEGF C 基因的表达，淋巴管生成和淋巴管密度减少，淋巴结转移的可能性减少。综上所述，本研究证明抑制 COX 2 的表达可以抑制肿瘤的生长，COX 2 可以作为利用 RNA 干扰技术进行相关肿瘤基因治疗的靶点。同时有肿瘤淋巴管生
15、成相关基因 VEGF C 表达7下调，这可能为 RNA 干扰技术用于肿瘤防治提供新的理论依据。【参考文献】1 Corcoran CA，He Q，Huang Y,et al.Cyclooxygenase 2 interacts with p53 and interferes with p53 dependent transcription and apoptosisJ. Oncogene，2005；24:1634 40.2 Yamagishi M，Noda M，Tatsumi Y,et al.Correlation between cyclooxygenase 2，proliferative a
16、ctivity，and mucin phenotype in human advanced gastric cancerJ.J Gastroenterol，2004；39:1143 9.3 Tang RF，Wang SX，Peng L，et al.Expression of vascular endothelial growth factors A and C in human pancreatic cancerJ.World J Gastroenterol,2006;12(2):280 6.4 Yonemura Y，Endo Y，Tabata K，et al.Role of VEGF C and VEGF D in lymphangiogenesis in gastric cancerJ.Int J Clin Oncol,2005;10(5):318 27.5 Shayan R，Achen MG，Steven A，et al.Lmphatic vessels in canc
