《microRNA-21对膀胱癌T24细胞增殖的影响及对VEGF和AP1蛋白的调节》由会员分享，可在线阅读，更多相关《microRNA-21对膀胱癌T24细胞增殖的影响及对VEGF和AP1蛋白的调节（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1microRNA-21 对膀胱癌 T24 细胞增殖的 影响及对 VEGF 和 AP1 蛋白的调节作者：杨国胜 刘百川 尹智峰【摘要】 【目的】 研究 microRNA-21(miR-21)对膀胱癌 T24 细胞系中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)和活化因子蛋白-1(activator protein-1， AP1)及 mRNA 表达的调节作用，探讨 miR-21 对膀胱癌 T24 细胞增殖的影响。 【方法】 用人工合成的 miR-21 相应的双链互补 DNA 片段，插入pSilencerTM 3.1-H1 neo 载体表达载
2、体，经测序鉴定后作为 microRNA 的表达质粒;用脂质体将 miR-21 高表达质粒转染进 T24 膀胱癌细胞，经 G418 筛选获得阳性克隆。用 RT-PCR 技术和 Western blot 方法分别检测该细胞系中 VEGF 和 AP1 的mRNA 和蛋白表达情况。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测膀胱癌 T24 细胞增殖的变化情况。 【结果】 Western blot 结果显示 miR-21 能够增加 VEGF 和 AP1 蛋白的表达，RT-PCR 方法分析显示 VEGF 和 AP1 mRNA 水平升高。MTT 显示转染后细胞的生长速率比未转染的细胞明显加快。 【结论】 miR-21 促
3、进 T24 膀胱癌细胞增殖， 提示可能与 VEGF 和 AP1 的低表达有关。 【关键词】 microRNA-21; VEGF; AP1; T24 细胞; 膀胱肿瘤Abstract： 【Objective】 To investigate the role of miR-21 on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and activator protein-1(AP1) protein and its mRNA， and to explore the effect of microRNA-21 in regu
4、lation of the proliferation of T24 bladder cancer cells. 【Methods】 Using the synthetic double-strand base pair (bp) DNA， which is based on the sequence of the miR-21， inserted the DNA of miR-21 into the vector of pSilencerTM 3.1-H1 neo， and cloned the microRNA highly expression plasmid. Then the miR
5、-21 plasmid were transferred into T24 with Lipofectamine 2000， consequently cell line with the miR-21 highly expression was established by screening with G418. The level of VEGF and AP1 mRNA and protein 2were measured by using RT-PCR and Western blotting， respectively. Methylthiazolyltetrazolium (MT
6、T) was used to analyze the proliferation of the T24. 【Results】 The Western blot results displayed that miR-21 promoted the expression of the VEGF and AP1 protein. RT-PCR also indicated that the mRNA of VEGF and AP1 increased. Compared with the control group， MTT method demonstrated that the growth r
7、ate of T24 treated with the miR-21 high expression was also significantly increased. 【Conclusion】 miR-21 can promote the proliferation of T24， suggesting that it was related to the low expression of VEGF and AP1.膀胱肿瘤是泌尿系统中最常见的肿瘤，在国内膀胱肿瘤的发病率在男性泌尿生殖器肿瘤中占首位，其中男性发病率约为女性的 3 4 倍，年龄以 50 70岁为多，严重危害人类的健康。mic
8、roRNAs (miRNAs)是一类可调控基因表达的内源性非编码单链小分子 RNA，长度约 18 24 个核苷酸，通过与靶 mRNA 特异的碱基配对，引起靶 mRNA 降解或者翻译抑制，产生转录后基因沉默。miRNAs 的作用涉及多种生理和病理过程，已有大量实验证据表明，miRNAs 在肿瘤1-2、心血管3-4、糖尿病5、胚胎发育6-7中异常表达。最新研究显示，microRNA 与膀胱癌关系密切，Gottardo 等8通过寡核苷酸芯片分析 27 例膀胱癌组织(25 例癌组织和 2 例正常组织)，分析发现 miR-223， miR-26b， miR-221， miR-103-1， miR-185
9、， miR?鄄 23b， miR-203， miR-17-5p， miR-23a 和 miR-205 表达显著上调。miR-21 在癌症中十分活跃，有研究显示其在乳腺癌9、肝癌10等癌症中高表达，但是其在膀胱癌中作用鲜有报道。我们的实验就 miR-21 对膀胱癌 VEGF 和 AP1 蛋白及 mRNA 表达的调节作用及膀胱癌 T24 细胞增殖的影响做了初步探讨，报道如下。1 材料与方法1.1 材 料膀胱癌 T24 细胞系(上海拜力生物公司);质粒提取试剂盒(Invitrogen);总 RNA3提取试剂盒(Invitrogen);RT 试剂盒(MBI);PCR 试剂盒(Invitrogen);L
10、ipofectamineTM 2000 转染试剂盒(Invitrogen);MTT 试剂盒(Sigma);引物合成(Invitrogen);载体 pSilencer-3.1 H1 neo (Ambion); E.coli DH5(Ambion)。1.2 方 法1.2.1 细胞的培养和 miR-21 高表达质粒的构建T24 细胞培养于添加 100 mL/L 胎牛血清的 1640 培养液中，37 ，体积分数为 5%的 CO2 孵箱中培养。根据 miR-21 的核苷酸序列 5-TAGCTTATCA GACTGATGTTGA-3， 首先用 DNA 合成技术得到第一链 DNA，接着用 DNA 连接反应合
11、成双链 DNA，之后插入 pSilencerTM 3.1-H1 neo 载体。将构建好的质粒转化进 E.coli DH5。转染后进行质粒扩增和提取。1.2.2 脂质体介导的细胞转染每孔 20 104 个细胞接种于六孔板中，24 h 后，按 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L G418 的量向相应孔中加入含有 100 mL/L 血清的培养基，每 4 d 换含抗生素的培养基，培养 14 d 后观察结果，然后根据观察结果，筛选出维持浓度。根据质粒提取试剂盒和 LipofectamineTM 2000 转染试剂盒的说明书进行转染。用维持浓度的培养液培养转染的细胞，筛选形成的阳性克隆，挑取阳
12、性克隆进行扩大培养，之后收集细胞进行 Northern blotting 鉴定。1.2.3 Western blotting 检测蛋白表达将蛋白提取之后，按照蛋白质定量试剂盒(Catalog Number：23250)的说明书进4行蛋白定量，将提取蛋白进行 Western blotting.1.2.4 RT-PCR 检测 mRNA 表达按照总 RNA 提取试剂盒(Invitrogen)说明书提取总 RNA，运用 Beacon Designer 2.0 软件进行引物设计，以(oligo)dT 为引物逆转录合成 cDNA 第一链，以 4 L 的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，-actin 为
13、内参照.取 5 L PCR 产物 1.5%琼脂糖凝胶电泳。1.2.5 MTT 法检测细胞的增殖0.25%胰蛋白酶消化单层培养的 T24 细胞，用含 100 mL/L 血清的 1640 培养基制成单个细胞悬液，以每孔 3 104 个细胞接种于 24 孔培养板中，每孔培养基600 L。将细胞放入 37 、体积分数为 5%的 CO2 培养箱中培养，待细胞长到 50%融合时更换无血清的 1640 培养基同步化 24 h，后加 100 mL/L 血清，在不同时间段(24， 48， 72 h)测值时往培养板中加入 10 MTT，继续培养 4 h，弃去培养基，加入 150 L DMSO，室温孵育 10 mi
14、n，待紫色结晶完全溶解后，用 Elx-800 酶联免疫检测仪测定 A570nm 值，以 A570nm 值代表细胞活力。1.2.6 统计学方法所有实验重复 3 次，结果以 x s 表示，用 SPSS 13.0 统计软件进行分析，以 P 0.05 为有统计学意义。2 结 果52.1 miR-21 高表达质粒构建选取经过初步鉴定的阳性克隆进行 DNA 测序，结果显示插入片段的阅读框正确，所测序列与目的序列一致。2.2 miR-21 高表达质粒细胞系的建立2.2.1 G418 筛选浓度的测定正常 T24 进过 14 d 的加药筛选，结果如图 1 所示，细胞在加 G418 筛选到 10 d 时，G418
15、 浓度为 1.0 g/L 培养液的样品，细胞已经全部死亡。在第 14 天时，G418浓度为 0.6 g/L 培养液的细胞样品尚有部分细胞存活， 浓度为 0.8 g/L 的细胞样品已经被全部杀死。选择 0.8 g/L G418 培养液的药物浓度为含高表达质粒阳性克隆筛选的加药浓度。2.2.2 含 miR-21 高表达质粒克隆的筛选用提取的质粒转染 T24 细胞，24 h 后传代，加 G418(0.8 g/L 培养液)筛选，培养 14 d 后观察所得结果如图 2。正常对照细胞已经全部杀死，转染了质粒的细胞形成了多个不同的阳性克隆，挑取克隆并扩大培养。2.3 稳定表达细胞系中 VEGF 和 AP1
16、表达情况检测2.3.1 稳定表达细胞系 VEGF 和 AP1 蛋白质的表达检测将经过鉴定的细胞系进行扩大培养，提取细胞总蛋白，对其进行蛋白定量后。经过电泳、转膜、孵抗、显影后获得如下结果(图 3)。结果显示，相对于正常组和空6质粒组，转染了 pSil-miR-21 高表达质粒的 T24 的 VEGF 和 AP1 蛋白表达受到了促进作用，其中 VEGF 蛋白的表达增加了(6.72 0.92)%(P 0.05)，AP1 蛋白增加了(7.94 1.28)%(P 0.05)， 而正常组、空质粒组的组间差异无统计学意义(P 0.05)。 2.3.2 miR-21 对 VEGF 和 AP1 mRNA 表达的影响用 AP1 和 VEGF 基因特异引物进行 RT-PCR 检测。AP1 的 PCR 条件：94 预变性 3 min， 94 变性 30 s、61.0 退火 30 s、72 延伸 1 min，30 个循环后再 72 终末延伸 5 min;VEGF 的 PCR 条件：94 预
