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1、1mig14 对伤寒沙门菌在高渗应激早期 基因表达的调节作者：夏秋风， 邹昕， 杜鸿， 高宇琳， 黄新祥【摘要】 目的： 探查伤寒沙门菌 mig14 在高渗应激下对若干基因表达的调节作用。方法： 用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌 mig14 基因缺陷变异株，用基因芯片分析高渗应激早期野生株和 mig14 缺陷株基因表达差异，并对部分结果采用实时荧光定量 PCR 进行验证。结果： 成功制备伤寒沙门菌mig14 缺陷株，高渗应激早期 mig14 变异株与野生株相比有 77 个基因表达下调和 72 个基因表达上调。 结论： mig14 可能是一种调节基因，主要参与调节细菌的物质和能量代谢。
2、 【关键词】 伤寒沙门菌； mig14； 高渗应激； 基因芯片分析Abstract Objective: To explore the function of mig14 of Salmonella enterica serovar Typhi in response to hyperosmotic stress.Methods： A mig14 gene deleted mutant of S.enterica serovar Typhi was constructed using the homologous recombination method by means of a suici
3、de plasmid; the difference of the gene expression between the wild strain and the mig14 mutant at earlystage of hyperosmotic stress was investigated by genomic microarray assay and partially confirmed by real time quantity reverse transcription PCR. Results： Successfully constructed a mig14 mutant;
4、about 77 and 72 genes were downand upregulated respectively at earlystage of hyperosmotic stress in mig14 mutant. Conclusion： mig14 may be a regulator, may primally regulate the substance metabolism and energy metabolism of Salmonella enterica.Key words Salmonella enterica serovar Typhi; mig14; hype
5、rosmotic stress; DNA microarrays原核生物的信号转导可由膜蛋白和胞内的效应调节蛋白构成的双组分调控系统执行。PhoP/PhoQ 是许多革兰阴性菌都有的一个重要的双组分调节系统，在低镁2或酸性条件下，膜上的 PhoQ 被激活发生磷酸化，后者再特异性地作用于胞内的PhoP，使其磷酸化激活1。磷酸化的 PhoP 可激活 slyA,mig14 等基因，这些基因与细菌耐受酸性环境有关2, 3。Brodsky 等2已经证明 mig14 能介导伤寒沙门菌抵抗多种抗菌肽的杀伤作用，但机制目前还不清楚。从基因序列分析发现，mig14 与 DNA 调节性蛋白基因有较小的同源性，提示它
6、也可能是一种调节蛋白。有研究表明,在沙门菌高渗应激早期 mig14 基因表达量明显增高4，因此怀疑mig14 在沙门菌耐受高盐渗透压环境中可能发挥着重要作用。本研究拟用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌 mig14 基因缺陷变异株，并通过用全基因组芯片分析技术，比较伤寒沙门菌野生株和 mig14 缺陷株在高渗应激早期的基因表达谱差异，以分析高渗应激条件下 mig14 在伤寒沙门菌中的作用。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株和质粒 伤寒沙门菌野生株 GIFU10007，大肠埃希菌 SPY372pir, 大肠埃希菌 DH5，pMD18T 载体，自杀质粒 pGMB151。1.1.2 引
7、物 根据 NCBI 公布的伤寒沙门菌 Ty2 基因序列信息，在 mig14 基因上游和下游设计两对特异性 PCR 引物：P1A/P1B 和 P2A/P2B，P1A 和 P2B 含BamH酶切位点，P1B 和 P2A 含 Bgl酶切位点。设计的上游片段 F1 长 459 bp，下游片段 F2 长 857 bp。根据 treC，cydA，pagP 和 invF 基因序列设计实时荧光定量 RTPCR(qRTPCR)引物，引物序列见表 1，引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。 表 1 引物序列表1.1.3 主要试剂 限制性内切酶 Bgl和 Bam H，T4 DNA 连接酶，碱性磷酸酶，3Ex Ta
8、q，dNTP，RNase H，XGal，DL2 000 和 Hind digest 分子质量标准以及 TA 克隆试剂盒均为 TaKaRa（大连）公司产品；质粒提取试剂盒（Axygen 公司）；胶回收试剂盒（Promega 公司）；IPTG（Sigma 公司）；胰蛋白胨和酵母提取物（Oxoid公司）；RNA 提取试剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒（Qiagen 公司）；反转录试剂盒（Invitrogen 公司）。1.1.4 主要仪器 PCR 仪（Mastercycler Personal，Eppendorf），高速冷冻离心机（Megafuge，HERAEUS），凝胶成像及分析系统（Syngene，
9、Gene），核酸检测仪（BioPhotometer，Eppendorf），电穿孔仪（BioRad），电热恒温干燥箱（Ecocell），核酸杂交仪（RollerBlot HB3D,Techne），基因芯片扫描仪（GenePix 4100A，Axon）。1.2 方法与步骤1.2.1 制备伤寒沙门菌 mig14 缺陷株 伤寒沙门菌 mig14 缺陷株的制备参考文献5进行，分别用引物 P1A/P1B 和 P2A/P2B 扩增出 mig14 基因上、下游同源性片段 F1，F2。用限制性内切酶 Bgl消化 F1 和 F2 片段后再用 T4 DNA 连接酶连接。用胶回收试剂盒回收 F1F2 连接片段，即 m
10、ig14 基因同源性缺损片段。将回收的片段做 TA 克隆后筛选出阳性克隆 T 载体送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，以确保剔除的碱基数为 3 的倍数。从阳性 T 载体上用 BamH酶切下 F1F2 连接片段后与自杀质粒 pGMB151 连接。再将连接产物用热击法转入 E.coli SPY372pir 感受态细胞。筛选出带有 mig14 基因同源性缺损片段的阳性克隆质粒。提取阳性克隆的自杀质粒后直接用电击法导入伤寒沙门菌野生株，将首次在氨苄西林平板上筛选的阳性菌落在含 5%蔗糖的 LB 平板上进行二次筛选，用 PCR（引物 P1A，P2B）观察伤寒沙门菌的重组变异情况。将连续 3 代完全重
11、4组菌定为稳定的缺陷变异株。1.2.2 基因芯片分析实验 将伤寒沙门菌野生株和 mig14 缺陷株分别接种于 1 ml 低渗的 LB 液体培养基(含 NaCl 50 mmol/L)过夜培养，第 2 天取 100 l 接种于相应的低渗 LB 培养液 20 ml 中，37 250 r/min 培养至对数生长期，D（600 nm）约为 0.6，加入 1 ml 5 mmol/L NaCl 于培养液中（含 300 mmol/L NaCl）, 37 250 r/min 振摇培养 30 min。将菌液于冰上放置 30 min 后离心（4 000 r/min，10 min，4）收集菌体，按照 QIAGEN R
12、NA 提取试剂盒的方法提取细菌总 RNA，并通过测浓度和纯度以及电泳观察的方法分析总 RNA 的质量。用 DNase I 消化残量 DNA 后，按照参考文献4进行 RNA 反转录和 cDNA 荧光标记、DNA 芯片杂交和数据分析。1.2.3 qRTPCR 实验 在高渗应激早期分别提取伤寒沙门菌野生株和 mig14 缺陷株的总 RNA，方法同“1.2.2”。20 l qRTPCR 反转录反应体系(4 g 总 RNA，4 l N8 随机引物，1 l dNTP，加灭菌蒸馏水至 13 l)，65温育 5 min 后置冰上，冷却 1 min 后加入 5Fs 缓冲液 4 l，0.1 mol/L DTT 1
13、 l，RNase out 1 l，反转录酶S 1 l。用 PCR 仪器进行反转录反应(25 10 min，50 50 min，70 5 min)。2 结 果2.1 伤寒沙门菌 mig14 缺陷株以野生株基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，成功获得 mig14 基因上、下游同源性核苷酸片段 F1 和 F2，并连接成 F1F2，经 TA 克隆后，将 F1F2 二次克隆至自杀质粒 pGMB151 中，连接产物的克隆鉴定见图 1，将阳性自杀质粒通过电击5转化入野生株，进行重组筛选，结果获得稳定的完全重组 mig14 缺陷变异株（图2），并经 DNA 序列分析得到进一步确证。2.2 基因芯片分析结
14、果先将野生株和 mig14 缺陷变异株在相同的条件下培养至对数生长期，再进行高渗应激,30 min 后提取 RNA，最后进行全基因组芯片分析，以比对整体基因表达差异。芯片杂交后采用 GenePix Pro6.0 软件（Axon Instruments）并辅以 Excel 软件对全基因组芯片分析结果进行图片处理和数据分析。计算扣除背景后的各样点荧光信号值（均值），采用全局归一法（global normalization）对双色荧光数据进行标准化处理，并计算每个点杂交后不同荧光物质标记所得信号比值（Ratio），以表达倍差异作为阳性变化阈值。结果显示，与野生株的基因表达相比，mig14 缺陷株在高
15、渗应激早期 fliDS,motA 和 cheRBZ 等 17 个鞭毛和动力相关基因以及 SPI1 毒力岛中的 prgHJK 等 5 个毒力基因表达均有明显下调，另有 79 个代谢酶类基因表达发生变化，其中下调的有 37 个基因，包括narGHJ，dmsAB，nrfACD，hypABCE，treBC，hybOABCDE 和 cydAB 等，上调的有 42 个基因，包括 sucAB，sucCD，sdhCDAB，astBD，fadAB 和 cyoABCE 等；有3 个调节基因 invF，sdiA，caiF 和一个假定的调节基因表达有明显下调；与药物耐受相关的基因 pagP 表达下调，ybjX 表达则
16、上调；此外，还有 26 个其他功能的基因（5 个基因表达下调）和 13 个未知功能的基因（8 个表达下调）也发生明显表达变化。从芯片分析结果可以推测 mig14 是一种调节基因，且可能主要参与调节伤寒沙门菌的物质和能量代谢以及鞭毛的装配和动力。 2.3 qRTPCR 结果为验证基因芯片分析结果，从基因芯片分析结果中选择分布在不同基因簇的基6因，包括 cydA，invF，pagP 和 treC 基因，进行 qRTPCR，比较分析伤寒沙门菌野生株和 mig14 缺陷株中相应基因表达情况(图 3)。基因表达谱分析结果显示，变异株中 cydA，invF，pagP 和 treC 的 mRNA 水平分别为野生株中的0.47，0.44，0.44 和 0.25 倍，而 qRTPCR 分析结果显示，变异株中的 mRNA 平均为野生株中的 0.40，0.44，0.67 和
