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1、湖南农业大学硕士学位论文芋种质资源遗传多样性RAPD分析姓名：陈丽平申请学位级别：硕士专业：蔬菜学指导教师：刘志敏20040501摘要挚f c b 如勰斑鼬。龆据拧搬 4 l l O G e r p 影皤n 离心l 瓤i n ；棼彀上清，魏等体积戴仿：异戊醉( 2 4 ：1 ，v v ) 再抽提一次，4 1 1 0 0 0 r p m m i n 离心8 m i n ：5 ) 取上清，加等髂积鞭冷游舅孬薅，溢鞫翻转数次鹾，一2 尊流淀3 融i n 葳遮寝；秘撬搬絮靛嚣淀，用7 0 乙醇冲洗2 3 次，鬣于超净工作台上稍吹于；7 ) 加2 u lO 1 耗缓冲液，瓣J | l2 u lR N a
2、 s o 添镰器液( 1 0 m g 确1 ) ，3 7 承浍3 黼 n 6 瀚i n ：8 ) 魏 等l 奉积辫 骞：箨戊簿( 2 4 ：l ，v v ) ，援匀，4 i 1 0 0 0 r p 影糙i n 亵，貉s 搬i n 鳓在毅嶷劐嚣上清溶液中加入2 倍体积预冷静无水乙醇，温和倒转几次，至出城白色絮状沉淀；l 将自德絮状沉淀挑出，用7 0 己簿洗涤沉淀2 次，放入4 冰箱内予燥；1 1 )二F 潦完矮，攘5 0 u lO 。| l 溶鼹沉淀。 。2 ，2G T 鹕法”“”提】议发：1 0 0 f r n o 】LT r i s H C l ( p H 8 O ) 、2 0 啪o l L
3、E D T A ( p H 8 O ) 、2 醺勰( 影v ) 、l 。毒瓣i A 辩勰i 、 参一蕊蒸乙黪、2 蛭P ￥p 。篡俸壤验豢 睾如下：1 ) 称敷O 堍新鲜叶片( 去主州1 脉) ，液氮研磨餍，在研钵内加3 m l c T A B 提取液，继续研黪成襁状；2 ) 分剐暇取l m l 磷麟液敬入两1 5 m l 离，管串，6 0 永浴O 糠n ，裂解纲嚣毽，湾继爨童，在绦滠过疆中，不辩轻较攥匀爱嶷渡；3 ) 8 e 0 鼢p 瓣细i n 枣心3 m i n ；4 ) 取上清，加释体积的氯仿：异戊醇( 2 4 ：l ，v v ) ，缓慢摇匀，使之成乳状波，4 l l O r p 辩加
4、i n 满心5 m i n ；5 ) 取上溃，加镣体积氯仿：异戊醇( 2 4 ：l ，v v )霉糖提一次，4 ll e O O r 鞍辩抽i n 褰一热翻 n 6 ) 敬一乏潘，露等体积鬏冷夔凳嚣簿，潺耪翻转数次爱，一2 0 沉淀3 隗i n 域避疲；7 ) 挑爨絮扶沉淀，羽7 0 乙醇冲洗2 3 次，鼹于超净工作台上稍吹干；8 ) 加2 0 0 u 1O 1 T E 缓冲液，樽加l u lR N a s e 酶辕鍪滚( 1 0 翔g 翩1 ) ，3 7 承漤3 0 蠡汹i 珏：棼趣簿簿积氯蕊：羹发簿2 4 ：l ，v A ，摇匀，4 l l O O O r p m m i n 离心5 m
5、i n ；1 0 ) 在收集刹的上清溶液中加入2 倍体积预冷晌无永己醇，漱和翻转几次，疆嘲现向色絮状沉淀：l ) 将向德絮状流淀撬硪，瑙? 0 乙醇洗涤浚淀2 次，敖入1 溶耱内予淡；1 2 予漾究螽，鸯羹5 0 H lO + i T 嚣溶解沉淀。 ，2 3 熬靛低渊毽浚脚“”疆毅滚：1 0 o l 屈辩盛e ( 簿，8 ) 、S 秘臻o l 盘辩凝矗( p | 1 8 。、l 。4 S B S ( 弹v ) 、嘲o l L 辩薛l 、l 弼转一巯基乙瓣、2 隧只熬穗穷囊嚣持巍瓣5 5 。凝镕试骏操作如下：1 ) 称取O 6 9 新鲜叶片( 去叶脉) ，液氮研磨艏，谯研钵内加3 m 1 提取滚
6、；继绥骈密戚鞭状 2 ) 分臻壤取l 穰l 磷瘗滚藤入嚣l ，妇l 掰，警孛，承漆 44 0 m i n ，在保温过程中，不时轻轻摇匀反赢液；3 ) 1 l o o O r p m m i n 离心1 0 m i n ；4 )程上渍滚中麓A2 3 髂积p i 4 ，8 豹2 ，5 嘲o i 危姒岛瀑匀骚萋于O 3 镪in 淀淀鬣白赝；5 ) 4 1 1 0 0 0 r p m m i n 离心1 0 m i n ，辩蛋白质沉淀 6 ) 在上清液中加入等体衩鞭冷鹣羚蕊酪，滏簿i 翻转数凌燕，2 0 流淀3 鳓 n 或过岌i7 将流淀拣爨，教人躬一无黼离心僻l h 加入o 5 m 1 无菌水将沉淀
7、溶解，4 l 1 0 0 0 r p m n l jn 离心i 。辩i n ，齐不溶稔；8 东上清波孛翔入等体积颈冷鼹雾蔼醇，澄麓癌予4 l l 0 0 0 r p i i l 向i n 离心1 0 m i n ，收集D N A 沉淀；9 ) 用7 0 己醇洗涤沉淀2 次，放入4 冰箱内干燥：l O ) 干墚完后，加5 0 u lO 1 T E 溶解流淀。 ，3 鞍矗P D 扩增爱应R A P D 反应在P T c 1 0 0 扩增仪上进行。反应体积为2 5 u i ，其中含2 飘l 豫b 鞋f 鑫r 2 0 翱m o l 虎T r i s 一拜c l ，1 0 0 f f I m 0 1 L
8、 ( N H 。) 。S 瓴，1 0 0 蝴o l LH e l ，1 T r i t o n x _ l O O ，2 0 0 删0 1 LM g C l ：，p 8 。8 ) ，2 5 n gD A ，O 3 7 u m o l L 随移t 弓l 帮，z u m o l ，Ld 浒P ( d A T P 、d G T P 、d i 墨P 、d 嚣秘，l U 王鞠D 凇聚套戆( 1 窳爨国生物技术公司产撼) 。反应糨序为；9 4 预变性3 m i n ，然艏9 4 变性1 m i n ，3 8 邋火l m i m7 2 瑟镩2 翳i n ，4 0 个键蓼，矮嚣7 2 筵穆泌i 狂。取1 0
9、拄l 匏怒翼扩增产魏与2 垃i 澳酚妪( 0 2 5 溴酚蓝，o 2 5 二甲苯氰蕊，4 0 蔗糖) 混匀，点入含有0 5 u g m 1黯靛l 。8 琼聪耱凝获中，在3 5 影e 熟鬯绣强度下邀溶2 3 b ，褒蠢凝菠，套D ( ) c 1 0 0 0 凝胶成像仪上逃行观察照相。1 4R A p D 反应条件优化确定最蓬葳应条锌辩，嚣庾瘟蒋系靛嚣素没羞不羁懿撵瘦_ 忒孚：模数孚凇浓度2 5 n g 2 5 u L 。，5 n g 2 5 u L ，1 0 n g 2 5 u 1 + 2 0 n g 2 5 u l ，4 0 n g 2 5 u 1 ，8 0 n g 2 5 u 1 ，i 6
10、0 n 影2 5 u l ，3 2 0 n g 鹰5 u l ，4 鼯n g 露甄l ，鲢O n g 2 5 槛l ；萼| 妨滚囊0 。 8 S u 穰。l 鹿，0 + 2 7 8 uJ I l o l L ，O 3 7 0 u m o l L ，O 4 6 3 u m 0 1 L ，O 5 5 5 u m o l L ，0 6 4 8 u m o l L ，O 7 4 0 u m o l L ，O 8 3 3 u m o l L ，O 9 2 5 u m o 熏乙，1 0 1 8 u m o 王乙；赫g e l 。2 。O m m o 圭L ，2 5 嚣臻o l l ；，3 0 狂拄B o
11、l L ，3 。5 琢m o l L ，哇，0 墨融o l L ；d N T P 勃蔓发O 1 0 m m 0 1 L ，O 1 5 m m o l L ，O 20 m m o l 几，O 2 5 m m o l L ，0 3 0 m m o l L ：T 籼D N A 聚合酶浓度O 5 I j ，0 ? 爨，1 。e 馨， 5 醛，2 。醛；循环次鼗势2 5 ，3 5 ，簦，4 l ，4 莲，4 7 遐火 基疫为3 2 ，3 3 ，3 4 ，3 5 ，3 6 ，3 7 ，3 8 ，3 0 ，4 0 。在照个反陂过程中，l S而改变外，熟余参数和反应条件不变，并相应地调热超纯水艟以保持反应体系
12、为2 5 “i ，淡确绦试验麴漆磕瞧鞫露蒎瞧汹“”。2 结果与分析2 1 基因组D N A 掇取方法比较2 。 ， 紫羚激羧裣澍将3 种方法提取的D N A ，分别在B e r k m a nD u 6 4 0 紫外分光光度计上测定其o D ：。O D 。、：。( 每个祥黼敬4 次的平均值) ，戬证实蹦A 的真截和计算猃溶液的浓度( 袭1 ) 。根据D N A 的浓度计算样品中D N A 产量，丽用O D 。o D 。、。0 D m 比值检测D N A 的质量。从袋l 可以看出，用S D S 法提取的D N A 的o D ，O 晚。和o D “0 D 璃低，说臻袋蠲北方法提取粒D 凇热离子、糖
13、类及蛋自质含量较高，纯度不好；用高盐低P H 法提取的D N A 的O D 。o D ：。较低，说明色素等小分子物质含量较高，耱。O p 。大予2 0 ，说鞠存程着一定整R 溅；蠢爰e l 熊法提鼗戆测是豹。相对要高，0 D 。0 D 。，接近1 8 ，说明采用此方法提取的D N A 纯度要高。一般纯D N A的。，0 大于2 0 ，O D 。：。等于l 。8 。表1 三种方法所得葶基因组D N A 的紫外分析结果1 t a b l elT h eg e n o r n l cD N Au l t r a n V i o l e tf e s I l l to f 3m e l h o d s
14、i nt a f o2 1 2 电濠检测将3 种方法提取的基因组D N A 分子在禽有O 5 u g m lE B 的1 O 的琼脂糖凝1 6胶上电泳分离结粱见图l 。3 种方法均能获得完懿的基因组D N A 分子，麒分子量大小为2 3 k b 左右。淀：依次为S D s 法、高盐低p H 值法、c T A B 法l ，2 ，3 ，4 分裂为莱鬻癸芋、菜鞠弧芋、蘩辫菝挚、摈样芋图1 三种方法提取芋总基因组D 帆电泳F i g 1G e n o m e 渊A e l c c 枉h o 瑶s i so f 3 琳戆碡s 穗强2 1 3f l p D 扩增检测以3 种方法提取的莱阳分芋基因维嬲A 为
15、横裁进行R 矗扩增，结采如图2 。露见3 秘方法提取的基趿组D N A 扩增出的带型渣躜一致。l ，2 ，3 分别为s D S 法、疆A B 法、菇盐低州值法图2 不同攫取方法R A P D 丰广增结果飘g + 2l b 谨D 戤矬p l l 曩e d 羚s u l lo f d i 曩毫r e n te x 拄a c t e d 脚氆o d s2 2R A p D 反应条件比较2 ，2 1 横板D N A 浓度对R A p D 反藏的影晌i A 趵对摸投D N A 的逶应性缎太。在2 5 H 1 的反应体系中，分别加入2 。5 ，5 ，1 71 0 。2 0 ，4 0 ，8 0 ，1 6 0 ，3 2 0 。4 8 0 ，6 4 0 n g 的模板D N A 。结果除6 4 0 n g 不能扩增外，萁德均毙扩增，毽爨在5 3 2 0 n g 之闯扩璞镶果一致，低予竣褰予藏蓖强扩增R 矗固谱带反而会变小( 圈3 ) 。弓I 起这种现象的主要原因可能是由于随机引物与不同浓度静模板黻结合鹣寄所不溺。为了有藉于获褥好的R 矗鞠谱豢，避免谱带豹减小或完全消失而改变R A P D 带型，柱R A P D 艇应中，必须对模板D N A 浓度进行最优化的选择，最佳酶模板浓度范围取
