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1、硕 士 学 位 论 文论 文 题 目（2013 届）黄芩素对 TGF-1 体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响研究生姓名 董 丽 霞指导教师姓名 顾振纶教授 蒋小岗副教授专业名称 药 理 学研究方向 肺纤维化和中药药理论文提交日期 2013 年 4 月1黄芩素对 TGF-1 体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响 中文摘要黄芩素对 TGF-1 体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响中文摘要目 的: 研究黄芩素(Baicalein, BAE)对 TGF-1 体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响，并初步探讨其作用机制。方 法: 体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞 WI-38
2、，制备 TGF-1 诱导肺成纤维细胞 WI-38 向肌成纤维细胞分化的细胞模型。采用 MTT 法检测 WI-38 细胞的增殖率，Western Blot 法检测细胞内 -平滑肌肌动蛋白(-smooth muscle actin, -SMA)、I 型胶原蛋(CollagenI, ColI) 及相关蛋白表达的变化，光学显微镜观察细胞形态，免疫组化检测细胞内 -SMA蛋白表达。随后在 TGF-1 体外诱导肺成纤维细胞 WI-38 向肌成纤维细胞分化的细胞模型上，给予不同剂量的 BAE 干预，用 MTT 法检测 BAE 对 WI-38细胞的增殖的影响，免疫组化法观察 WI-38 细胞内 -SMA、Sm
3、ad2 蛋白的表达，透射电镜观察 WI-38 细胞中细胞器的结构改变，扫描电镜观察 WI-38 细胞表面结构改变。Westorn Blot 检测 WI-38 细胞分化过程中相关蛋白 -SMA、ColI、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3 、Smad7 蛋白的表达，以 Reverse Transcription PCR 法检测 BAE 对TGF-1 体外诱导肺成纤维细胞 WI-38 细胞向肌成纤维细胞分化过程中 -SMA、ColI、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA 表达的影响。结果：MTT 法检测表明：与正常 WI-38 细胞组相比，540 gL-1 TGF-1
4、作用WI-38 细胞 4 d 后，细胞增殖率上升 (P98%，批号：MKBC3540。样品溶于 DMSO 中，贮存浓度为 100 mM, -20 保存，实验时用 RPMI-1640 完全培养基稀释为工作浓度。1.2 试剂氯 仿 、 异 丙 醇 、 乙醇 等 为 国 产 分 析 纯 试 剂 ， 使 用 时 按需 要 配 制 。 ReveresTranscription PCR 相关试剂：焦炭酸二乙酯（ DEPC） 、Trizol RNA 提取液、逆转录试剂盒，Taq 聚合酶、100 bp DNA Ladder 、琼脂糖均购自大连宝生物工程有限公司。2 仪器设垂直电泳槽，VE-180 型，上海天能
5、公司；转移电泳槽，VE-186 型，上海天能公司；近红外双色激光成像系统扫描仪，Odessay, USA；倒置显微镜，Nikon Eclipse TS100,Japan；高速低温离心机，5417R 型，Eppendorf, Germany；稳压电泳仪，EPS 300 型，上海天能科技有限公司，近红外双色激光成像系统扫描仪，Odessey, USA；凝胶成像系统，Tanon-2500 型，上海天能科技有限公司；基因扩增仪，MyCycler Thermal Cycler,BIO-RAD, USA。24黄芩素对 TGF-1 体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响 第二部分3 溶液配制1TAE
6、缓冲液 (pH 8.0)1 ml of 1M TrisCl, pH 8.0 (灭菌)0.2 ml of 0.5 M EDTA, pH 8.0 (灭菌)98.8 ml of 蒸馏水Total Volume (100ml)2.5% 戊二醛戊二醛 1 ml10 PBS 9 ml二 方法1 BAE 干预WI-38(8x104/ml) 细胞悬液接种于 6 孔板，每组设 4 个复孔，方法同上，除正常对照组换新鲜 RPMI-1640 (含 0.1% FBS) 外, 5gL-1 TGF-1 作模型，加入 2000 nM、1000 nM、500 nM 、250 nM、125 nM 浓度的黄芩素，于 37，5%
7、CO2 培养箱中作用 4 d。光学显微镜观察细形态的改变，免疫组化法观察 BAE 对 WI-38 细胞内 -SMA和 Smad2 蛋白的影响。透射电镜观察细胞器结构的改变，扫描电镜观察 WI-38 细胞表面结构变化。Western Blot 及 RT-PCR 检测相关蛋白和 mRNA 的表达，同时免疫组化检测法观察 -SMA、Smad2 蛋白在细胞中的变化。2 Reveres Transcription PCR2.1 总 RNA 的提取在无 RNA 酶条件下，倒出培养液，用 1PBS 清洗一次，每 10 cm2 生长的培养细胞中加入 1ml 的 RNAiso Plus，水平放置片刻，使裂解液均
8、匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后吹打细胞使其脱落，将内含细胞的裂解液转移至 A 离心管中，室温静置 5min。12000g ，4 离心 5 min，小心吸取上清液，移入另 B 离心管中，加入 200l 的氯仿，剧烈震荡 15s，12000g 4 离心 15 min，此时匀浆液将分为三层，吸取500 l 上清液转移至 C 离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温静置 10min，12000g 4 离心 10 min，小心弃去上清，缓慢的沿离心管壁向管底的沉淀中加入 75%乙醇 1 ml，轻轻上下颠倒洗涤离心管， 12000g 4 离心 5 min，25第二部分 黄芩素对 TG
9、F-1 体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响小心弃去上清，室温干燥沉淀 25min，用 25l DEPC 水溶解待用。总 RNA 纯度测定：OD260/OD280 比值在 1.82.1 之间。RNA 浓度=(OD260 -OD280)2500.04 gL-1。2.2 RT-PCR 引物该实验采用的引物均为 GenBank 获取 cDNA 全序列后，由 Vector NTITM Suite 6.0软件设计，均由上海生工生物工程有限公司合成如 Tab.3。Tab 2. Premiers used for PCR amplificationGene Sequence bp-SMA Sense
10、 5-GGTGCTGTCTCTCTATGCCTCT-3 305Anti-sense 5-AACTCTTCTCAAGGGAGGATGA-3ColI Sense 5-CCTGGAAAGAATGGAGATGATG-3 147Anti-sense 5-CAAACCACTGAAACCTCTG-3Smad2 Sens 5-AGGTATCCCATCGAAAAGGATT-3 189Anti-sense 5-ATACTGGAGGCAAAACTGGTGT-3Smad3 Sense 5-GGGGTGAAAGCATTACAGAGAG-3 300Anti-sense 5-AGAGGGAATGAGAGGACACAAA-3
11、Smad7 Sense 5-GCCGAGGATCTGTAAATTGTGT-3 303Anti-sense 5-CAGAGAGGAGAGTCAGGTCACA-3actin Sense 5-GCTGTTTTCCCATCCTTGT-3 103Anti-sense 5-CTCTTTTGCTCTGTGCTTCGT-32.3 cDNA 第一链合成取 0.5 L 离心管，分别加入如下试剂：5PrimeScriptTM Buffer 8 lPrimeScriptTM RT Enzyme Mix1 2 lOligo dT Primer (50M)1 2 lRandom 6 mers (100M)1 2 lTot
12、al RNA 2 lTotal Volume (40l)2.4 反转录条件如下：37 15min (反转录时间)85 5 sec (反转录酶失活时间)26黄芩素对 TGF-1 体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响 第二部分将得到的 RT 产物反应液加入到下一步的 Reveres Transcription PCR 反应体系中，其加入量不要超过 Reveres Transcription PCR 反应液的 1/10 (V/V)。2.5 Reveres Transcription PCR 反应体系各管中依次加入如下试剂 (总体积 50 L)：TaKaRa Ex Taq (5U/ l) 0.
13、25 l10 ExTaq Buffer (Mg2 Plus ) 5 ldNTP Mixture (各 2.5mM) 4 l模板 DNA 2.5ng引物 1 (20M) 1 l引物 2 (20M) 1 l灭菌蒸馏水 up to 50 l按照如下 PCR 扩增程序进行扩增2.6 PCR 程序扩增程序如 Tab 3.Tab 3. Amplification procedure used for Reveres Transcription PCRGene Temperature and time sequence-SMA 95 8min31 cycles of 95 30sec 60 30sec 72
14、 60sec72 10min4ColI 95 8min31 cycles of 95 30sec 60 30sec 72 60sec72 10min4Smad2 95 8min31 cycles of 95 30sec 55 30sec 72 60sec72 10min4Smad3 95 8min31 cycles of 95 30sec 55 30sec 72 60sec72 10min4Smad7 95 8min31 cycles of 95 30sec 55 30sec 72 60sec72 10min4actin 95 8min31 cycles of 95 30sec 60 30se
15、c 72 60sec72 10min42.7 图像处理及数据分析PCR 产物用 1.2 %琼脂糖凝胶电泳，结束后于全自动凝胶成像分析系统进行灰度扫描并计算各组相对灰度值，计算公式如下：相对灰度值=各组对应目的基因灰度值/各组对应内参灰度值实验重复三次，各组数据均取均数标准差（ x s） ，组间比较用SPSS 16 统计软件进行统计处理。27第二部分 黄芩素对 TGF-1 体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响3 扫描电镜操作步骤：(1) 弃取上清，PBS 洗涤 2 次；(2) 2.5% 戊二醛固定液固定 3 h；(3) 缓冲液洗涤 3 次，每次 10 min ；(4) 30% 叔丁醇(无水乙醇配置)洗涤 10 min；(5) 50% 叔丁醇(无水乙醇配置)洗涤 10 min；(6) 70% 叔丁醇(无水乙醇配置)洗涤 10 min；(7) 80% 叔丁醇(无水乙醇配置)洗涤 10 min；(8) 90% 叔丁醇(无水乙醇配置)洗涤 10 min；(9) 叔丁醇洗涤 3 次，每次 10 min ，最后一次放入 4冰箱；(10) 脱水 10 min ，喷金，扫描电镜观察。4 透射电镜观察超微结构观察操作步骤：(1) 弃取上清，加入新鲜培养基 5-10 min 后，收集 1106-107
