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1、1细菌内同源重组快速构建和制备表达 hSDF作者：唐俊明,郭凌郧,孔霞,杨建业,潘国栋,陈龙,黄永章,王家宁【关键词】 同源重组；人基质细胞源衍生因子Construction of recombinant adenoviral plasmid bearing hSDF1 cDNA by homologous recombination in bacteria and preparation of recombinant adenovirus expressing hSDF1【Abstract】 AIM： To construct recombinant adenoviral plasmid c
2、ontaining hSDF1 cDNA using homologous recombination in bacteria and to prepare recombinant adenovirus expressing hSDF1. METHODS: Adenoviral backbone plasmid was transformed into competent BJ5183 and the competent BJ5183 transformed with pAdEasy1 was prepared. The linearized pShuttleEGFPhSDF1 plasmid
3、 with Pme I digestion and CIAP dephosphorylation was transformed into the competent cells BJ5183 transformed with pAdEasy1. The identified recombinant adenoviral plasmid pAdEGFPhSDF1 was digested with Pac I and transfected into AD293 cells with cationic liposome LipoVec to package recombinant adenov
4、irus AdEGFPhSDF1. AdEGFPhSDF1 was propagated by repeated rounds of infection of AD293 cells with supernatant of the recombinant adenovirus. AdEGFPhSDF1 was purified with CsCl density gradient ultracentrifugation. RESULTS: pShuttleEGFPhSDF1 was successfully transformed into competent BJ5183 transform
5、ed with pAdEasy1 and homologous recombination between pAdEasy1 and pShuttleEGFPhSDF1 took place within BJ5183 bacteria. Liposomemediated transfection of pAdEGFPhSDF1 digested with Pac I into AD293 cells was performed. The packaging of recombinant adenovirus AdEGFPhSDF1 within AD293 cells was confirm
6、ed by fluorescent microscopy. The viral titer was 4.11015 pfu/L. CONCLUSION: The recombinant adenovirus expressing hSDF1 was prepared successfully by a simple and rapid homologous recombination in bacteria. This study provides a basis for exploring the migration mechanism of bone marrowderived stem
7、cells into injured tissue such as infarcted myocardium.【Keywords】 homologous recombination； hSDF1； adenovirus； gene therapy【摘要】 目的：利用细菌内同源重组快速构建携带 hSDF1 cDNA 重组腺病毒2质粒和制备表达 hSDF1 重组腺病毒. 方法： 制备感受态 BJ5183，将 pAdEasy1转化 BJ5183，制备含 pAdEasy1 的 BJ5183 感受态，将线性化的pShuttleEGFPhSDF1 转化含 pAdEasy1 的 BJ5183 感受态菌. 采
8、用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒 pAdEGFPhSDF1. pAdEGFPhSDF1 用 Pac I 线性化后，再用 LipoVec 介导其转染至 AD293 细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒，采用CsCl 密度梯度离心法纯化重组腺病毒 AdEGFPhSDF1. 采用荧光显微镜下观察LipoVec 介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况. 结果：pShuttleEGFPhSDF1 成功地转化了含 pAdEasy1 的 BJ5183，并在其内发生了同源重组. 荧光显微镜下观察证实了 pAdEGFPhSDF1 转染 AD293 后，产生了重组腺病毒 AdEGFPhSDF1. 病毒滴度为
9、4.11015 pfu/L. 结论：用细菌内同源重组法可快速、高效制备表达 hSDF1 的高滴度重组腺病毒. 为研究 hSDF1 在动员骨髓源干细胞迁移到组织损伤部位修复组织损伤的研究奠定了基础.【关键词】 同源重组；人基质细胞源衍生因子 1； 腺病毒；基因治疗0 引言基质细胞源衍生因子 1(stromal derived factor1, SDF1)属 CXC 型趋化因子. 同基因编码两种蛋白:SDF1 和 SDF1,其受体 CXC 型趋化因子受体 4（CXC chemokine receptor 4, CXCR4）是一个具有 7 个跨膜结构域的 G 蛋白耦联的受体1. 研究发现 SDF1
10、是 CD34+造血干细胞的趋化因子,CD34+造血干细胞能沿SDF1 浓度梯度向骨髓迁移实现归巢1-3. 同时,SDF1 在骨髓动员中也发挥了重要作用4-6. 而已知骨髓内除了含有造血干细胞外,至少还含有内皮祖细胞、间充质干细胞. 近来研究表明移植的内皮祖细胞、间充质干细胞通过参与或促进血管3新生和心肌再生而明显改善了受损心脏的功能. 但是国内外关于 hSDF1 动员骨髓源内皮祖细胞、间充质干细胞的作用研究很少,尤其 hSDF1 在心肌梗死后动员骨髓源间充质干细胞靶向迁移到心梗部位的作用研究更是甚少. 因此,为进一步探索 hSDF1 在骨髓动员、迁移中的作用,非常有必要制备表达 hSDF1 的
11、重组腺病毒.1 材料和方法1.1 材料 质粒与菌株：pORFhSDF1 质粒、脂质体 LipoVec 购自 Invivogen公司；腺病毒骨架质粒 pAdeasy1,穿梭质粒 pShuttleIREShrGFP2，AD293，BJ5183和 XL10gold 购自 Stratagene 公司；pGEMT Easy vector 购自 Promega 公司；DH5a由郧阳医学院临床医学研究所保存; 限制性内切酶：EcoR V，Xho I，Pac I 和Pme I 购自 New England Biolabs 公司；DNA Hind marker, 200 bp DNA ladder, dNTP,
12、 Taq 酶、T4 DNA 连接酶购自华美生物工程公司；hSDF1 cDNA 扩增引物：上游引物为 5 GAT ATC ATG AAC GCC AAG GTC GTG GTC 3,下游引物为 5 CTC GAG TTA CTT GTT TAA AGC TTT CTC 3由北京赛百盛生物公司设计合成,上游、下游引物 5端分别带有 EcoR V, Xho I 位点; 仪器:高速冷冻离心机(UNIVERSAL 32R,德国),超速冷冻离心机(Hitachi，CP8OMX，日本),倒置相差荧光显微镜(Nikon，TE2000U，日本),PCR 仪(Biometra, 德国),紫外/可见光分光光度计(C
13、ecil，CE2041，英国), 台式高速冷冻离心机、水浴摇床等.1.2 方法1.2.1hSDF1cDNA 的扩增以 pORFhSDF1 为模板,20 mmol/L 的上下游引物各 5 L, pfu DNA 聚合酶 1 L, 10buffer 5 L, 10dNTP 5 L,加双蒸水至总反应体积 50 L. 进行聚合酶链（polymerase chain reaction, PCR）反应：起始变性 94 5 4min,然后执行 94 30 s, 55 30 s, 72 30 s, 30 次循环,最后 72延伸 10 min.1.2.2“T”连接反应参照本所已建立的方法7-8,将回收纯化的 27
14、9 bp PCR 产物,加入 10PCR buffer 5 L, 10MgCl2 5 L, 2 mmol/L dATP 2 L, Taq 酶 2 L,加双蒸水至总反应体积 50 L,72孵育 30 min. 回收纯化加“A”后的 hSDF1 cDNA片断（281 bp）,加 10T4 DNA 连接 buffer 5 L, pGEMT Easy vector 0.5 L,T4 DNA连接酶 1 L,加双蒸水至总反应体积 10 L,室温连接 3 h. 将连接产物转化 DH5,涂布含氨苄青霉素（100 mg/L）的 LB 琼脂培养基上培养 12 h,蓝白筛选,挑选白色单菌落接种于含氨苄青霉素（100
15、 mg/L）的 TB 培养基中培养 12 h,提取质粒 EcoR V 和 Xho I 酶切鉴定. 重组质粒命名为 pGEMThSDF1.1.2.3 穿梭质粒 pShuttleEGFPhSDF1 的构建将 pShuttleIRESHrGFP2 和pGEMhSDF1 分别用 EcoR V/Xho I 双酶切后，低熔点琼脂糖凝胶电泳，分别回收 8.8 kb 的穿梭质粒片段和 279 bp 的 hSDF1 cDNA，用 T4 连接酶连接过夜. 然后转化感受态 DH5a,小量培养,经酶切鉴定正确后大量培养,抽提质粒 DNA 备用.1.2.4pAdEGFPhSDF1 重组腺病毒质粒的制备取 1.0 g 的
16、腺病毒骨架质粒pAdeasy1 转化感受态 BJ5183,挑取含 pAdeasy1 的 BJ5183 菌,大量扩增后制备含pAdeasy1 的超感受态 BJ5183. pShuttleEGFPhSDF1 经 Pme I 酶切 24 h 后,直接用无水乙醇沉淀 DNA,再用碱性磷酸酶(CIAP) 50， 30 min 去磷酸化,经 7 g/L 低熔点琼脂糖凝胶电泳,回收线性化去磷酸化的 pShuttleEGFPhSDF1,经酚、氯仿抽提后转化含 pAdeasy1 的超感受态 BJ5183. 挑 3 个单克隆菌落,小量培养,碱裂解法小量提取质粒,经 PacI 酶切,7 g/L 琼脂糖凝胶电泳,若出现一大于 23 kb 和 4.5 kb或 3.0 kb 的特征性条带,即为阳性质粒. 将重组的 pAdEGFPhSDF1 在 XL10gold5中大量扩增.1.2.
