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1、1Rho 家族蛋白在肿瘤侵袭转移中作用【关键词】 恶性肿瘤侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特征，也是患者死亡的主要原因。人类对肿瘤转移机制的研究已经有一百多年历史，随着对肿瘤转移基因调控多阶段、多因素、多步骤理论的不断完善，对于这一复杂病理过程有了更深入的认识。发现并证实与肿瘤转移高度相关的基因成为当前肿瘤转移机制研究的热点，因为这些基因及其产物可能成为肿瘤抗转移治疗新的靶点或观察患者预后的重要指标。Rho 家族蛋白是 Ras 超家族中最早被克隆出来的蛋白，它们是一组相对分子质量大约为2025kD 的三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)结合蛋白，具有 GTP 酶活性，因
2、此，习惯被称为 Rho GTP 酶，Rho GTP 酶在细胞骨架重组调控方面起重要作用。近年来研究发现，Rho GTP 酶在多种恶性肿瘤中高表达，并和肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关。本文主要从肿瘤细胞形态改变，细胞与胞外基质粘附以及细胞骨架重组等几个方面，对 Rho GTP 酶作用于肿瘤侵袭转移的分子调控机制综述如下。1 Rho GTP 酶到目前为止，Rho GTP 酶超家族已发现约 20 个成员，根据结构和功能不同，大致分为 5 个亚家族，包括：(1)Rho 亚家族，包括 RhoA、RhoB 和 RhoC，在序列上具有高度同源性，并在多种细胞中高表达，主要参与张力纤维形成和粘着斑复合体(fo
3、cal adhesion complexs，FACs)组装；(2)Rac 亚家族：包括 Rac1、Rac2、Rac3和 RhoG，促进层状伪足和胞膜皱褶形成；(3)Cdc42 亚家族，包括Cdc42、TC10、TCL、Wrch1 和 chp/Wrch2，其中 Cdc42 促进丝状伪足形成：(4)Rnd2亚家族：包括 Rnd1、Rnd3/RhoE 和 Rnd2，在细胞中组成性激活表达并具有不同的组织分布，可拮抗 Rho 信号通路；(5)Rho BTB 亚家族，包括 Rho BTB1 和 Rho BTB2，具体功能尚不清楚。在所有 Rho GTP 酶超家族成员中，Cdc42、Rac1 和RhoA
4、是目前研究最多的 Rho GTP 酶。Rho 家族各成员在氨基酸序列上有50%55%的同源性，在靠近催化位点处都有 1 个能和 GTP 结合的功能区,与催化 GTP 水解密切相关。Rho GTP 酶同 Ras 超家族的其他成员一样，羧基端通常具有共同结构域，即由半胱氨酸残基，脂族残基和其他氨基酸残基组成的末端，是翻译后修饰的位点。Rho GTP 酶的翻译后修饰与其质膜定位有关，只有经翻译后修饰的 Rho GTP 酶才具有活性并能与细胞膜上适宜的脂质分子结合。在异戊烯基转移酶的作用下，半胱氨酸的巯基和异戊二烯基团间共价形成硫醚键，并在内切酶的作用下水解掉末端其余 3 个残基，最后异戊二烯基化的半
5、胱氨酸残基在甲基转移酶的作用下发生甲基化，完成翻译后的修饰。Rho 家族蛋白同 Ras 超家族的所有成员一样在活性型/GTP 限制型和失活型/二磷酸鸟苷(guanosine diphosphate，GDP)限制型构象之间循环。调节这个循环过程的 3 类重要蛋白是：(1)鸟苷酸交换因子(guaninenucleotide exchanging factors，GEFs)，催化 GDP 的释放和GTP 的结合，活化 Rho GTP 酶。不同的 Rho GEF 在结构上都具有相同的功能域，包含 1 个 DH(Dbl homology domain)区和 1 个 PH(pleckstrin homol
6、ogyv domain)区，前者与 Rho GTP 酶结合并催化其构象改变，后者通过和细胞膜上特定的脂质作用使 GEF 在膜上定位；(2)GTP 酶活化蛋白(GTPase activating protein，GAP)，作为负向调节因子加速 Rho GTP 酶的水解，使 Rho GTP 酶由活性状态变为无活性状态；(3)GDP 解离抑制因子(GDP dissociation inhibitor，GDI)，阻止 GDP 从 Rho GTP 酶上分离，抑制 Rho GTP 酶活性。Rho GTP 酶是细胞内多条信号转导通路的关键分子，作为分子开关在胞内信号转导中发挥桥梁作用。Rho GTP 酶可参
7、与对正常细3胞增殖、分化、凋亡的调节，并与肿瘤的发生和转移密切相关。实验研究发现，在多种肿瘤中可见 Rho GTP 酶表达异常，改变细胞内 Rho GTP 酶的表达水平可以直接影响肿瘤细胞侵袭和转移的过程。2 Rho GTP 酶与肿瘤的侵袭转移肿瘤细胞在基质中的运动由 4 个循环往复的步骤组成，即头部伪足的形成和延伸，新粘附位点的建立，胞体的收缩以及尾部的退缩，通过不断重复的 4 个过程向前迁移。对这一过程精确调节的分子机制非常复杂，涉及胞内多条信号转导通路。在多条信号级连反应通路中，Rho GTP 酶尤其是 RhoA、Rac1 和 Cdc42 是关键的调控因子，主要参与对细胞形态改变，细胞与
8、基质粘附及细胞骨架重组的调控，调节肿瘤细胞的侵袭转移过程。21 细胞形态改变 伪足形成和细胞形态改变是侵袭转移的起始步骤。Rac 可诱导质膜突起形成片状样的层状伪足，而 Cdc42 诱导指头样突起的丝状伪足形成。在高侵袭和转移性的肿瘤细胞，还可见一种侵袭伪足形成，由于与细胞外基质降解密切相关，可能成为主要的伪足结构。层状伪足与周围基质形成粘附连接，产生细胞向前运动的锚着位点；丝状伪足有助于细胞对周围环境的适应及确定细胞迁移的方向。WiskottAldrich 综合征蛋白家族(WiskottAldrich syndrome protein，WASP)是调节细胞迁移的关键分子，包括神经组织来源 W
9、ASP(neural WiskottAldrich syndrome protein，NWASP)，WASP 家族富含脯氨酸同源蛋白 1(WASP family verprolinhomologous protein1，WAVE1)，WASP 家族富含脯氨酸同源蛋白 2(WASP familyverprolinhomologous protein2，WAVE2)等成员，也是 Rac和 Cdc42 下游的重要效应子，在肿瘤细胞中高表达，Rac 和 Cdc42 通过活化WASP 家族成员诱导伪足形成和基质降解。Lorenz 等首次使用荧光共振能4量传感器区分活性状态和失活状态的 NWASP 构象，
10、并模拟内源性 NWASP 功能发现，NWASP 在迁移的肿瘤细胞头部层状伪足形成中起重要作用。细胞迁移头部高度动态性伪足结构的形成依赖肌动蛋白单体聚合和肌动蛋白纤维的延长，WASP 家族不同成员通过不同的结构域与 Rac 和 Cdc42 结合而活化，而肌动蛋白相关 2/3 复合体(actinrelated 2/3 complexs，Arp2/3 complexs)和肌动蛋白单体通过分别结合于活化的 WASP 家族羧基端共同的结构域，直接调控肌动蛋白单体聚合。Arp2/3 复合体是肌动蛋白组装的核心，可将肌动蛋白单体从头合成组装为肌动蛋白丝，进而促进丝状伪足和层状伪足的形成。Arp2/3 复合体
11、与 WASP 的结合是调控肌动蛋白聚合的重要因素，两者在多种肿瘤细胞中共表达，对 115 例肺腺癌组织切片免疫组化染色发现，78 例(678)共表达 Arp2/3 和 WAVE2，并与病人临床生存时间负相关；多变量回归分析揭示，Arp2/3 和 WAVE2 的共表达是肿瘤复发的独立危险因素。并且 NWASP 和 Arp2/3 复合体也是高侵袭和转移性肿瘤细胞侵袭伪足形成的主要调节子，并可能成为肿瘤治疗的重要靶位11。肌动蛋白单体的聚合和伪足形成还依赖另一种关键调节子 cofilin，cofilin 可使肌动蛋白单体从肌动蛋白丝的顶端解离，诱导肌动蛋白丝从头部折断，产生新的末端。Rac 和 Cd
12、c42 可通过活化共同的底物 p21 激活激酶(p21activated kinase，PAK)，分别激活 LIM(3 种同源异型结构域蛋白 lin11、isl1 和 mec3)激酶 1(LIM kinase1，LIMK1)和 LIM 激酶 2(LIM kinase2，LIMK2)，磷酸化 cofilin 使其失活而抑制肌动蛋白的解聚，稳定肌动蛋白细胞骨架。22 细胞基质粘附 伪足形成启动细胞迁移的过程，但细胞持续的迁移需依赖细胞伪足与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的稳定粘附，提供细胞向前迁移的牵引支点。迁移的细胞头部与 ECM 的粘附和尾部与 ECM 的去粘附
13、的不断交5替使得细胞向前迁移，Rho GTP 酶对这一过程发挥精确的调节。细胞表面的整合素受体与 ECM 中特异的配体结合，通过整合素聚集成簇而形成 FACs，而整合素受体的胞内区与桩蛋白(paxillin)，纽蛋白(vinculin)和踝蛋白(talin)等多种肌动蛋白结合蛋白相互作用形成分子桥，并与细胞骨架相连，提供细胞迁移的锚着位点。活化的 Rac 可诱导肌动蛋白的聚合和层状伪足的形成，同时也能诱导新的 FACs 的形成，而 FACs 的形成又能反过来活化 Rac，这一正反馈的失控可增加肿瘤细胞的侵袭能力。Jung发现，活化的 Rac1 和 Cdc42，可通过激活 PAKl 磷酸化下游的
14、粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)，活化的 FAK 作为分子支架招募胞浆中桩蛋白，纽蛋白和踝蛋白等至 FACs，促进 FACs 的形成。p65 激活激酶还可通过 LIMK 间接调节 cofilin 的活性，cofilin 在活性型和失活型间的循环可调节肌动蛋白亚单位从肌动蛋白丝末端的解离和聚合，并对促进肌动蛋白纤维组装时踏车(treadmilling)现象的发生非常必要。肿瘤细胞侵袭和转移与 ECM 的降解密切相关，Rho GTP 酶可直接或间接调节下游效应子促进 ECM 的降解。对人乳腺癌细胞株 MDAMB435 的研究发现，Rac1 和 Cdc42 可通过间接
15、活化 LIMKl 上调丝氨酸蛋白酶尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase type plasminogen activator，uPA)系统，增加 uPA 启动子活性，诱导 uPA 和 uPA 受体 mRNA 和蛋白表达及 uPA 的分泌，降解 ECM 胶原等成分，有助于细胞的侵袭转移。 23 细胞骨架重组 侵袭和转移的肿瘤细胞的持续运动需依靠张力纤维收缩和肌动蛋白丝的延长提供动力，Rho GTP 酶可通过调节细胞骨架的重组，为细胞迁移提供动力。张力纤维是真核细胞中一种稳定的、平行排列的微丝结构，由肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白等组成，肌动肌球蛋白相对运动产生的收缩力是细胞迁移动力的主要来
16、源。Rho 及其下游的 Rho 相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated 6coiledcoil forming protein kinase，ROCK)可提升肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)的磷酸化水平，增加肌动-肌球蛋白的收缩力促使细胞在 ECM 中的迁移。ROCK 是 Rho 下游的重要效应分子，包括 Rho 激酶和 p160ROCK 2 个成员。活化的 ROCK 通过 2 条通路提升 MLC 的磷酸化水平，一方面 ROCK 磷酸化其底物肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)的肌球蛋白结合亚单位(myosinbinding subunit，MBS)而抑制 MLCP 的磷酸酶活性，减少 MLC 磷酸基团的水解；另一方面，ROCK 可直接磷酸化 MLC，增加 MLC 的磷酸化水平，从而增加与肌动蛋白丝交联产生的收缩力。抑制 Rho/Rock 通路能抑制肿瘤细胞张力纤维的收缩和细胞侵袭，显
