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1、ELISA 操作流程操作流程前前处处理理1匀浆样本：取一定量（约 100-150g）的样本进行匀浆，匀浆样本以无颗粒状为为佳。样本匀浆好以后再利用称样勺搅拌样本，以充分混合不同个体的样本，达到均质的效果。2称量样本：利用 0.01g 当量的电子天平称量相应的样本重量，误差尽量控制在0.02g,以提高结果的准确度。样本直接称取到 50ml 离心管中。称量的样本应尽量称取匀浆效果比较好的样品。3加入提取液：在相应的样本中加入对应的提取溶剂，溶剂的体积在条件允许范围内尽量精确。4提取或萃取：加入相应的提取溶剂以后，拧紧离心管盖，利用涡旋仪充分振荡样品，以样本与提取液充分混合为准。具体时间可参考说明书
2、所提供的方法时间要求。5离心：把处理好的样品对称放置在离心机中，盖上离心机盖门，直到听到离心机盖门关闭声音，按“离心”键进行离心，离心时间一般设为5min，离心速度一般设为 4500rpm/min。如果样品离心效果不佳则可以加大离心力或延长离心时间再次离心。6移取液体：利用加样枪移取对应的的溶剂液体至另一个容器中；如果需要吹干浓缩的样品，则移取到干净干燥的玻璃管中；如果是取下层进行分析的样品则移取全部上层液体，利用下层进行分析。移取液体的时候请注意避免移取到不相关的液体层，以免造成污染。7浓缩吹干：先利用甲醇把氮吹仪的针头进行润洗，具体方法是先打开空气压缩机的开头，先通以少量气流，把装有甲醇的
3、容量浸泡针头前端，浸泡时间约 1-2s 即可。润洗针头后，把装有样品的玻璃管放在下面水浴锅的相对应的固定夹子上，再打开气流阀门，以能感觉到气流声音为准，再缓慢把针头伸到液面上方，以吹动液面为限，在浓缩吹干过程中应不断调整针头的高度，以节省吹干时间。吹干的样品以没有液体流动的判定依据，亦可在吹干后再吹大约 2-3min 左右。严禁在没有吹干的情况下就取下样品进行下一步操作。8复溶：加入对应的复溶工作液后，再加入相应的除杂溶剂，利用涡旋仪振荡溶解，此步骤时间不宜过长，大约 10s 左右即可。样样本分析本分析1回温平衡：在加样之前约半小时左右，把试剂盒从冰箱中取出，放置在室温下进行平衡，平衡到用手握
4、住试剂瓶感觉到不凉为止。如果时间匆忙的话也可以利用手握住试剂瓶进行快速回温。2加样：取出相应数量的微孔板放置在板架上，然后再对板孔进行编号，再对需要稀释的抗体或酶标记物进行稀释。在板孔的前六个孔内分别加入标准品 1-6，然后在剩下的板孔内加入样品分析液。然后再在每孔内加入其余需要加入的液体。盖上盖板膜以后小幅度振荡，然后放置在相应的环境中进行反应。如是 25环境反应，则可放置在空调房内进行反应；如果是 37环境下反应，则必须放置在 37恒温培养箱里进行反应，如果是 4环境下反应，则必须放置在 2-8 度冰箱里进行培养。3反应时间：尽量把时间控制在需要的反应时间，如果时间比较紧迫的话也可以把时间
5、稍微延长几分钟，但不宜太长。显色时间可根据颜色深浅进行调整。3洗板：把板内液体甩干，加入稀释好的洗液 250ul/孔，静置 10s 或稍作振荡后甩掉孔内液体，再次加入洗液，以此重复 3-4 遍，洗完以后利用吸水纸把孔内液体充分拍干后进行下一步操作，如果孔内有气泡，则利用干净的枪头刺破。4. 结束实验:把加样枪全部调到最大量程,试剂盒放入冰箱,试管及离心管进行清洗,关闭不用的仪器.详细项详细项目的目的 SOP 请见请见附附录录部分！部分！附录：氯氯霉素霉素操作步骤完成与否1称取 3g0.02g 样本于 50ml 离心管中；2利用移液管或加样枪加入 6ml 乙酸乙酯；3盖上离心管盖，利用涡旋仪振荡
6、 1min 左右；4把振荡好的样品对称放置于离心机中，按照 4500rpm/min 离心 5min；5离心结束后小心取出样本，小心取 4ml 于 10ml 干净干燥燥玻璃管中；6把取出后的样本放在氯吹仪上吹至完全干燥；拿出试剂盒回温；7把浓缩复溶液用去离子水 1：1 稀释备用；可适当多稀释一点；8取出吹干的玻璃试管，分别加入稀释好的复溶液和正已烷各 1ml；9把加入溶液的试管利用涡旋仪复溶，振荡 10s 左右；10把复溶好的样品试管对称放在离心机中，按照 3500rpm/min 离心 5min；11小心取出离心过的样品，利用加样枪去除上层正已烷层；12在板架上放置需要的板孔数目，板孔数目为样本
7、个数+613把抗体利用稀释好的复溶液按 1：10 的比例稀释，混匀备用；14在前六个孔内分别加入 50ul 标准品 1-6，其余孔内分别加入样本各 50ul15在所有的板孔内加入 50ul 稀释好的抗体工作液；16盖上盖板膜，轻轻振荡后放在室温下反应 1h；17把浓缩洗液利用去离子水按照 1：19 的比例进行稀释，备用；18揭开盖板膜，甩出孔内液体，每孔加入 250ul 洗液，静置 10s，甩出液体；19重复洗板步骤 3-4 遍，在吸水纸上拍干；20每孔加入 100ul 酶标记物，盖上盖板膜，在室温下反应 30min；21甩出孔内液体，进行洗板步骤，洗板结束再次拍干孔内液体；22每孔分别加入
8、50ul 底物 A 液与 B 液，盖上盖板膜轻轻振荡，于室温下反应 30min；如果颜色过深可缩短反应时间；23每孔加入 50ul 终止液，在酶标仪上进行读数；24利用分析软件进行结果分析。呋呋喃喃唑酮唑酮操作步骤完成与否1称取 1g0.02g 样本于 50ml 离心管中；2利用加样枪加入 4ml 去离子水，0.5ml 1M 盐酸，100ul 衍生化试剂；3盖上离心管盖，利用涡旋仪振荡 1min 左右；4把处理好的样本放在 37恒温培养箱过夜，培养时间12h；5取出培养过夜后的样本，加入 5ml 0.1M K2HPO4及 5ml 乙配乙酯，稍作振荡；6把振荡好的样品对称放置于离心机中，按照 4
9、500rpm/min 离心 5min；7离心结束后小心取出样本，取 2.5ml 上层液体于 10ml 干净干燥燥玻璃管中；8把取出后的样本放在氯吹仪上吹至完全干燥；拿出试剂盒回温；9把浓缩复溶液用去离子水 1：1 稀释备用；可适当多稀释一点；10取出吹干的玻璃试管，分别加入稀释好的复溶液和正已烷各 1ml；11把加入溶液的试管利用涡旋仪复溶，振荡 10s 左右；12把复溶好的样品试管对称放在离心机中，按照 3500rpm/min 离心 5min；13小心取出离心过的样品，利用加样枪去除上层正已烷层；14在板架上放置需要的板孔数目，板孔数目为样本个数+615把抗体利用稀释好的复溶液按 1：10
10、的比例稀释，混匀备用；16在前六个孔内分别加入 50ul 标准品 1-6，其余孔内分别加入样本各 50ul17在所有的板孔内加入 50ul 稀释好的抗体工作液；18盖上盖板膜，轻轻振荡后放在室温下反应 30min；19把浓缩洗液利用去离子水按照 1：19 的比例进行稀释，备用；20.把浓缩酶标二抗利用稀释好的复溶液按照 1:10 的比例进行稀释;21揭开盖板膜，甩出孔内液体，每孔加入 250ul 洗液，静置 10s，甩出液体；22重复洗板步骤 3-4 遍，在吸水纸上拍干；23每孔加入 100ul 稀释后酶标二抗，盖上盖板膜，在室温下反应 30min；24甩出孔内液体，进行洗板步骤，洗板结束再次拍干孔内液体；25每孔分别加入 50ul 底物 A 液与 B 液，盖上盖板膜轻轻振荡，于室温下反应 15min；如果颜色过深可缩短反应时间；26每孔加入 50ul 终止液，在酶标仪上进行读数；27利用分析软件进行结果分析。
