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1、用凯式定氮法测定样品中的氮含量用凯式定氮法测定样品中的氮含量一、实验目的一、实验目的 1、掌握凯氏定氮仪的使用方法； 2、掌握凯氏定氮法测定样品总氮量的基本原理和操作； 3、用凯氏定氮仪测定生物样品中氮的含量或粗蛋白的含量。二、实验原理二、实验原理 样品中含氮有机物经浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水，然后有机物碳化生成碳， 碳将硫酸还原为 SO2，本身则变成 CO2，SO2使 N 还原为 NH3，本身则氧化为 S2O3而消化 过程中生成的 H2，又加速了 NH3的形成。在反应过程中，生成的 H2O 和 S2O3溢出，而 NH3则与 H2SO4结合成（NH4）2SO4存于溶液中，加和 NaOH，
2、并蒸馏，使 NH3溢出，用 H3BO3吸收后，用已知摩尔浓度的酸滴定，测出样品中的全氮含量，乘以氮与蛋白质的换 算系数（大多数食物换算系数为 6.25,乳制品为 6.38,面粉为 5.70） ，即为粗蛋白质的含量。三、实验器材三、实验器材 凯氏定氮系统（foss8200）：消化装置、蒸馏装置 试剂配制均使用分析纯级试剂：浓硫酸、加化剂（K2SO4与 CuSO45H2O 质量比 1：15 混 匀研磨经 40 目筛过滤而得） 、40% 氢氧化钠、4% 硼酸、无水硫酸铵、0.05M 盐酸、混合 指示剂（100 毫克甲基红与 500 毫克溴甲酚绿分别溶于 100 毫升无水乙醇后以 1：1 比例混 合而
3、成） 、无水碳酸钠、蒸馏水 饱和硼酸：取 6g 硼酸加蒸馏水定容到 100ml，加热溶解，待冷却后有结晶析出，说明溶液 已饱和。四、实验步骤四、实验步骤 、样品制备、样品制备 使用适宜的实验室粉碎磨或粉碎机把样品粉碎。称量 0.6g 样品到 250ml 的消化管中， 精确到 0.1mg。、消化、消化 用称量纸称好待测样品后，将称量纸把待测样品包裹严实一起放入消化管（防止待测 样品撒在消化管壁） ，在消化管中加入 6g 加化剂，14ml 浓硫酸。轻轻的摇动，将样品浸湿。 打开消化装置电源，将消化管就位放好，盖上排废罩，打开水抽气泵或排废装置。设置消 化时间 t = 60min，温度 T = 42
4、0 oC。消化 60min 后，将消化管连同排废罩一起取出，关闭 消化电源，冷却 15min。 （此时，消化管内溶液呈蓝绿色或者浅黄色，表示消化完全）、蒸馏、蒸馏 在 FOSS8200 装置中，蒸馏工作是自动完成的。依次打开冷凝水管、电源开关，确保 H2O、H3BO3、NaOH、废液等桶与仪器连接好。在液晶显示窗口设置参数，其中蒸馏参数 为：稀释液（H2O）80 ml，碱液（40% NaOH）80 ml，接收液（4% H3BO3）30ml，蒸馏时 间 t 为 5min。空蒸参数：稀释液（H2O）150 ml，碱液（40% NaOH）0 ml，接收液（4% H3BO3）30ml，蒸馏时间 t 为
5、 5min。 蒸馏时，先选择空蒸参数，此时连接空消化管，空接收瓶，蒸馏 5min，使仪器回路充 气。再选择蒸馏参数，在接收瓶内加 3 滴混合指示剂，连接好消化管，按照设置参数，系 统自动用 80ml 蒸馏水稀释冷却的消化液，在接收瓶内加入 30ml 的硼酸接收液，加入 80ml的 40% NaOH 到消化管中（变褐色） 。蒸馏 5 分钟，然后用 0.05M 标准盐酸滴定，当接收 瓶溶液变为无色，再滴加 12 滴盐酸，溶液变浅红，滴定完毕。 *：每批样品均要做空白实验。做完实验后，需要对碱液通路清洗，将饱和硼酸加入碱液通 路，使中和通路中的 NaOH，防止腐蚀。 颜色变化：蒸馏时接收瓶，暗红色蓝
6、色浅蓝色滴定时接收瓶，蓝色灰色无色浅红色、计算、计算（T-B）x M x 14.007 氮%= 样品毫克数x 100 %蛋白质% = N2 % x 6.25 ( 面粉为 5.7，牛奶为 6.38 ) T = 样品滴定耗用盐酸量（ml） ； B = 空白实验耗用盐酸量（ml） ； M = 盐酸标准液的摩尔浓度，mol/L； 14.007=1mol/L 盐酸标准液 1L 相当于氮克数。备注：备注： 1、标准盐酸的标定为了获得准确的氮/蛋白质分析结果，必须要保证盐酸的浓度符合要求，因此需按照下 述方法或国标方法用碳酸钠滴定盐酸。 配制：取9ml浓盐酸溶于蒸馏水中，并定容至1000ml。称取约10克无
7、水碳酸钠（Na2CO3)，研成细粉，在265干燥1小时或200干燥2小 时，在干燥器中冷却后移入烧杯，盖紧，在干燥器中存放。 标定：用分析天平称取约0.1克基准Na2CO3，记取重量（W1） ，移入锥形瓶，加40毫升蒸馏水，再各加8滴甲基红和溴甲酚绿指示剂，用盐酸标准液滴至粉红色，记下所用盐酸毫升数 （A1)。将椎形中的溶液煮沸几分钟，再用自来水冲凉至室温，此时粉红色褪去，继续使用 盐酸滴定至粉红色复现，记下滴定毫升数（A2） 。再将椎形瓶中的溶液煮沸几分钟，然后用 自来水冲凉至室温，此时粉红色褪去，继续使用盐酸滴定至粉红色复现，记下滴定毫升数 （A3） 。备注：温度会影响标准溶液的体积和浓度
8、。使用标准溶液时的温度应该和标定时的温度接 近。如果需要对温度进行校正，可使用校正表。 计算： 18.870 x W1HCl的摩尔浓度= -A1 + A2 + A3注意：浓度必须精确到小数点后4位，例如0.1000mol/l。2、每隔一定时间检测蒸馏装置的氮回收率，一般蒸馏装置氮的回收率在 99.5%以上即可继续使用。回收率测定时，称取 0.15 克（NH4）2SO4入消化管，再系统自动加 80m 蒸馏水， 及 50ml 40% 的 NaOH，然后蒸馏，用盐酸滴定，记录盐酸的消耗量，计算（NH4）2SO4 的回收率。实际含氮% 回收率= 21.09x 1003、加入适量的混合指示剂到碱溶液中，如出现暗绿色说明其还可以用，PH5.0 以下为暗红 色；PH5.1 为灰绿色；PH5.2 以上为绿色。一般混合指示剂在酸中酒红色，在碱性溶液中为 绿色，其变色点为 PH=5.1。 4、加了指示剂的硼酸接收液应该是暗紫色（或蓝紫色） ，若溶液仍为红色，应加碱调节， 可用 0.1M NaOH 滴定至灰色。（公卫学院实验中心）
