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1、投稿信箱:p i g s t o d a y v i p . 1 6 3 . c o m2 0 0 7年第3期P I GS T OD A Y!在过去的几年里, 我们对猪副嗜血杆菌感染的认识已经大大提高。用于临床诊断的聚合酶链式反应 (P C R) 和分离菌群的基因组分型, 加强了我们对病菌感染的流行病学的认识。尽管我们在寻找有效的方法上还有很长的路要走,但现有的猪副嗜血杆菌诊断技术, 在进行疾病的监测和管理方面却是非常有用的。本文主要描述了目前猪副嗜血杆菌的一些诊断技术, 同时也探讨了每个技术的优势及缺陷, 以及如何解释数据等。一、 细菌分离猪副嗜血杆菌革兰氏染色呈阴性,需要在烟酰胺腺嘌呤二核
2、苷酸 (N A D)的环境下生长。该菌在常规的培养基中不能生长, 如血琼脂, 除非琼脂里面添加了N A D。N A D, 又叫V因子, 可以直接添加到培养基上, 或者由金黄色葡萄球菌的培养条提供, 或者将含饱和N A D的条形纸放在血琼脂上面。猪副嗜血杆菌只在N A D的周围生长, 可以产生 “卫星现象” 。小的、 半透明的、 非溶血的在N A D周围显示卫星现象的菌落是副嗜血杆菌。同时也要注意到其他N A D依赖的细菌, 包括吲哚放线杆菌、 少数放线杆菌、 猪放线杆菌, 可以从猪的组织(主要是肺) 中分离出来, 会被错误地鉴定为猪副嗜血杆菌。区别这些菌种所需要的生化试验可以参见表1。解释:猪
3、副嗜血杆菌可以从健康猪只的鼻腔、 气管和肺脏中分离。只有当猪群的猪副嗜血杆菌病似乎应该呈阴性的时候, 从上面器官分离的该细菌才有意义。具有重要临床意义的分离群来自于胸膜、 心包、 肝脏、 脾脏、 关节和脑膜。这些分离群应该进行药敏试验, 而且还要进行血清分型和基因组分型。猪副嗜血杆菌也可以从患有严重胸膜肺炎的肺脏中分离出, 这也可能是导致此类肺部损伤原发病原。二、 药敏试验抗生素被广泛用于猪副嗜血杆菌引起的疾病预防和治疗。可以用纸片扩散法或者肉汤稀释法来进行药敏试验。检测的原则和标准由临床和实验室标准协会 (C L S I) 提供。 根据这个协会的规定, 为几种特殊的抗生素建立了专门的标准。目
4、前, 对于猪副嗜血杆菌的检测来说, 没有可供参考的标准。用于胸膜猪副嗜血杆菌的诊断评注 (闫之春) :此文是猪副嗜血杆菌主要研究者S i m o n e Ol i v e i r a博士对该病最新研究进展做的详尽综述。在每段概要描述了一个诊断方法之后, 她都指出了这种方法的主要用途和局限性, 全文简明扼要。与国外相似, 猪副嗜血杆菌病也是造成我国集约化猪场保育肥育期猪死亡的最主要的病原。 临床上, 病猪往往出现严重发烧, 部分带有关节肿胀和中枢神经症状, 死亡率很高。更为重要的是, 猪副嗜血杆菌病的发病很快, 确诊和治疗都有困难, 要求猪场技术员能在整个群体大量发病之前1 2 d就能发现病猪,
5、 并对整个猪群采取控制措施。 由于已确定的该菌血清型就多达1 5种, 未定型的还有1 0 %以上, 不同血清型的发病特点、 交叉保护, 甚至治疗用药都可能不同, 确定自己猪场发病时主要的菌株类型非常重要。 在实际诊断和控制这种疾病时, 本文综述的各种诊断方法, 对商品疫苗和自家苗的制备有重要的意义。胸膜肺炎放线杆菌少数放线杆菌猪放线杆菌吲哚放线杆菌猪副嗜血杆菌溶血+-C A MP+-脲酶+-吲哚-+-触酶-+用阳性 (+) 和阴性( - )来表示反应表1用来区分5种从猪的组织中分 离出来的N A D依赖菌的最少生化实 验要求刘明成译河南农业大学闫之春审美国谷物协会北京1 0 0 0 0 4美国
6、谷物协会特别供稿猪场保健3 1N O . 3 , 2 0 0 7网址:w w w . p i g s t o d a y . c o mP I GS T OD A Y!肺炎放线杆菌和嗜血杆菌的步骤和标准被用作这个营养需求复杂的微生物的检测。纸片扩散法是将饱和的抗生素通过琼脂培养基渗透到纸片上。将含有生长菌落的悬浊液培养至浊度为0 . 5号麦氏管浓度。在1 5 mi n的培养时间内,用无菌棉拭子蘸取调好的菌液,用棉拭子在平板表面划线,将细菌接种到琼脂平板上。将确定好的药敏纸片贴到平板表面, 轻轻地往下按压, 以保证与平板表面完全接触。将平板倒置于3 7 的恒温培养箱中,1 8h后, 进行检查。用
7、尺子测量抑菌圈的直径大小, 然后和C L S I公布的各抗菌药物的标准进行对照。微量稀释法, 就是在一系列装有肉汤的试管内添加了不同浓度的抗生素。然后将培养的待测菌落的悬浮液接种各个试管, 在3 7 条件下, 经过一夜的培养后, 进行检测, 并确定其最小抑菌浓度 (MI C) , 用MI C来确定阻止菌落眼观生长所需要的抗生素的最小浓度。据报道, 不同的诊断实验室, 药敏试验的结果不一样。几个因素会影响猪副嗜血杆菌对药物的敏感性。猪副嗜血杆菌因为对培养基的特殊需求而被定义为营养需求复杂的微生物。C I S I已经给出了一些关于检测营养需求复杂的微生物的培养基的制备的建议。然而,方法上的一点不同
8、, 不同的实验室所得出的结果也不一样。另外一个会影响猪副嗜血杆菌对药物敏感性的因素是所使用的检测方法, 一些实验室用纸片扩散法, 而另一些则用微量稀释法, 两种方法所得得结果可能不一样。明 尼 苏 达 大 学 兽 医 诊 断 实 验 室(MNV D L) 用纸片扩散法来检测猪副嗜血杆菌的耐药性。根据目前的一些资料, 该方法产生的结果容易再现, 更值得信赖。药敏试验中使用的药品包括:氨苄西林、 头孢噻呋、 头孢噻芬、 金霉素、 克林霉素、 红霉素、 氟甲砜霉素、 壮观霉素、 磺胺二甲氧嘧啶、 四环素、 泰妙菌素、 替米考星等。来自于MNV D L关于猪副嗜血杆菌的耐药性的最新信息如图1所示。根据
9、这个数据, 猪副嗜血杆菌对大多数抗生素都敏感。然而, 据报道最近在一些抗生素中已经发现了耐药基因, 这些抗生素经常在养猪生产中使用。在猪副嗜血杆菌分离群的质粒中发现了四环素的抗性基因, 特别是四环素B ,这个猪副嗜血杆菌是从发病的猪场分离的。 -内酰胺耐药基因近来也有特点了。基因型方法的使用可以提高我们对抗生素耐药性的认识。解释:有时,猪副嗜血杆菌不能在测试其耐药性的培养基中生长。 在这些情况下,抗菌敏感性的情况趋势可以用作筛选药物以进行治疗。有时细菌对某种药物敏感, 但治疗的时候, 可能达不到效果。尽管纸片扩散法和微量稀释法存在很多缺陷,特别当测试需要复杂营养的微生物时。许多其他的因素, 包
10、括管理措施、 管理方法, 顺应性和病毒的并发感染, 都可能会影响抗生素的治疗效果。三、 血清分型猪副嗜血杆菌的血清分型为商业疫苗的选择提供了很多重要的信息。在血清型相同的一个群体内, 可以很好的保护, 然而, 不同血清型之间的交叉保护并不多见。有两种方法可以对猪副嗜血杆菌的血清进行分型: 琼脂凝胶沉淀实验(A G P T)和间接血凝实验 (I H A) 。A G P T是第一个用于猪副嗜血杆菌血清分型的实验。该方法使用的是热处理的抗原。提取的准备工作就是将细菌的悬浮液在1 2 1 的条件下高压灭菌2h,然后离心,上层清液用于血清分型。A G P T在一个载玻片上操作, 载玻片上有一层琼脂凝胶,
11、 凝胶的孔内装有抗原或者专门用于猪副嗜血杆菌的1 5种血清型的兔子的血清的琼脂凝胶。经过2 4h的培养后, 可以读出沉淀线。I H A也要用热处理的抗原。把经过福尔马林灭活的细菌细胞煮沸后, 离心,取上清液并和绵羊红细胞 (S R B C)混合。这个试验用微量滴定法。首先要在U型底微量平板的孔中准备好一系列双重稀释的血清溶液, 然后将致敏的S R B C悬浮液添加到平板的孔中, 然后在3 7 条件下培养2h。I H A滴度用与确实隐性 (底部平滑散点) 的对照组相比, 确证为阳性 (平面沉淀) 的最高稀释倍数的倒数来表示。文献 报道,A G P T得 到的分离 群中, 有1 5 % 4 1 %
12、没有对应的血清型, 而I H A的结果中, 只有不到1 0 %的分离群没有对应的血清型。解释:图1来自于明尼苏达大学兽医诊断实验室的猪副嗜血杆菌的耐药请况猪场保健3 2投稿信箱:p i g s t o d a y v i p . 1 6 3 . c o m2 0 0 7年第3期P I GS T OD A Y!目前已知猪副嗜血杆菌有1 5个血清型。 使用A G P T和I H A进行血清分型试验是非常直接的。然而, 结果分析的主观性却非常大。一些分离群不能在体外产生足够的抗原来进行分型。不同血清型之间的交叉反应可能会出现。交叉反应的结果用在几个阳性结果中最强的那个来表示。没有型号的分离群可能会产
13、生交叉反应, 它能够消弱血清型的精确分配。他们也可能代表新的血清型, 其抗血清还没有出现。四、P C R检测药敏试验、 血清分型和基因组分型的前提是将猪副嗜血杆菌从临床样品中分离出来。然而, 这种营养需求复杂的微生物需要在特殊的培养基上才能生长。 在室温的条件下, 只能存活很短的时间 (8 h) 。从死猪体内取出的样品, 检测呈阴性。近来我们规范了一个专门用于检测临床样品中的猪副嗜血杆菌的P C R(H p s -P C R) 。MNV D L提供的H p s - P C R对以前的P C R作出了一些修改。新的P C R测试专门用于猪副嗜血杆菌的检测, 通过对V D L的3 0 0个送检样品
14、的常规检测来验证这种新的P C R技术。从患有纤维蛋白性浆膜炎的器官的表面收集的纤维蛋白用于细菌分离和P C R检测。在这3 0 0个样品中,1 4 6(4 8 . 6 %) 个样品的猪副嗜血 杆 菌 的P C R检 测 呈 阳 性 ,3 7个(1 2 . 3 %) 细菌分离呈阳性。P C R阳性和分离阳性的绝大多数样品来自于急性损伤的组织 (P C R1 0 4个, 细菌分离2 2个) ,这些组织的损伤是通过组织病理学鉴定的。9个亚急性损伤的样品和2 0个慢性损伤的样品的P C R检测都为阳性,细菌分离分别为3个和7个阳性。P C R检测的猪副嗜血杆菌的样品包括了其他一些细菌, 它们是: 猪
15、放线杆菌、 胸膜肺炎放线杆菌、 吲哚放线杆菌、 少数放线杆菌、 放线杆菌、 出血败血性博氏杆菌、 大肠杆菌、 链球菌。通过P C R方法测试这些菌种的结果是阴性的, 证实了这种测试方法用于猪副嗜血杆菌的专一性。这种P C R也可以成功地检测来自于急性损伤样品的猪副嗜血杆菌, 这些样品的细菌分离结果呈阴性。 对于诊断由猪副嗜血杆菌引起的感染来说,这种P C R比传统的细菌分离要敏感的多。解释:P C R阳性说明在样品中检测到猪副嗜血杆菌的D N A。在P C R阳性的基础上进行的猪副嗜血杆菌的诊断是有效的。然而, 应该继续进行细菌分离用于药敏试验、血清分型和基因组分型。只有当猪群的猪副嗜血杆菌检
16、测呈阴性的时候, 来自于鼻腔、 气管、 肺等组织的样品的P C R的阳性结果才有意义。扩P C R的送检样品应该包括存在于胸膜、 心包、 腹膜, 肾、 脾, 肝, 关节和脑膜这些器官的纤维蛋白性渗出物。可以用一个棉拭子收集纤维蛋白性渗出物。尽管脑(脊)膜炎的病例在眼观上没有损害, 但还需要在脑的表面取样进行细菌分离和P C R检测。五、 基因组分型猪副嗜血杆菌的基因组分型试验运用了肠杆菌基因间可重复P C R ,也叫E R I C - P C R。这种方法大大提高了我们对猪副嗜血杆菌的流行病学的认识。E R I C - P C R可以识别同血清型间菌株的差异, 因此更适于做流行病学的研究。它揭示了猪副嗜血杆菌各分离群之间存在高度的遗传变异性,也有助于鉴别呼吸型与全身型菌株之间的不同。这项技术目前主要用于鉴别猪群的毒株来源,进一步发现导致猪只死亡的菌株,从而为制作自家苗筛选菌株提供方便。它是一个重要的工具,能对猪副嗜血杆菌的感染起到监测、 预防和控制的作用。E R I C是由一系列D N A序列组成的, 这些序列遍布于细菌的基因组。这
