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1、湖南农业大学硕士学位论文湘研十六号种子纯度的RAPD分析姓名：陈俊良申请学位级别：硕士专业：蔬菜学指导教师：周群初;刘志敏20050401湘研十六号种子纯度的R A P D分析摘 要随 着分子生 物学的 迅猛发展， R A P D ( 随 机扩增多 态性D N A ) 标记技术己 广泛应用于生物学诸多领域。本文应用 R A P D技术对湘研十六号种子纯度进行了鉴定，并对R A P D技术的最适条件进行了探讨。分析了模板D N A的制备和反应组分对R A P D的影响。最终 确定最 佳反应体 系为: 总体系为2 5 u l ， 模板D N A 量为2 5 -5 0 n g , M 解1 2 浓度
2、为2 . O m m o l / L ， 引物浓度为1 5 -4 5 n g , d N T P 浓度为0 . 2 m m o l / L , T a q D N A 聚合酶根据其活性为1 . 0 -1 . 5 U .反应程序为:9 4 预变性5 m i n , 9 4 变性4 0 s , 3 7 退火4 0 s , 7 2 0C 延伸9 0 s ,循环4 0 次，再7 2 后延伸7 m i n o鉴定和分析了品种真实性与亲本多态性。 本文在筛选引物前进行了 父母本以及F l 代杂交种子品种真实性鉴定与亲本多态性分析，实验结果是:在利用S 6 1 ,5 1 0 0 2 引物鉴定父母本时，结果发
3、现父母本的均一性好， 在父本、母本各5 粒种子内部之间的R A P D指纹图谱一样，均未发现假种子。筛选出应用于黄瓜种子纯度鉴定的引物和建立了亲本及其杂交种子的R A P D指纹图谱。从1 0 0 引物中筛选出了应用于黄瓜种子纯度鉴定的引物6 条:偏母型引物 ( 5 1 0 , 5 3 2 0 ) 、偏父型引物( S 6 1 , S 7 4 ) 、互补型引物( 5 1 0 0 2 , S 3 0 1 ) e利用 5 1 0 0 2鉴定湘研十六号的纯度发现:发现父母本无其它种子混杂而在 F : 代杂交种子中发现2 号，7 号，3 6 号，6 2 号，6 5 号为假杂种。R A P D技术能够用来
4、鉴定辣椒种子纯度， 而且在建立其反应体系与反应程序后具有相当高的可靠性与准确性。关键词:辣椒 R A P D 纯度鉴定 D N AT HE P URI T Y I DE N TI F I CA TI ON OF CAP S I CUMHYBRI D W I TH RAP D MARKERSAb s t r a c tWi t h t h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f Mo l e c u l a r B i o l o g y , R A P D ( R a n d o mA m p l i fi e d P o l y m o 印h i c D
5、N A ) h a s b e e n a p p l i e d w i d 街 i n B i o l o g i c a l f i e l d s . T h i s t h e s i s f o c u s e d o n t h e a p p l i c a t i o n o f R A P D t o t h e P u r i ty i d e n t i f i c a t i o n o fc a p s i c u m h y b r i d s e e d s a n d re s e a r c h e d i n t o t h e o p t i m a l
6、 c o n d i t i o n s o f R A P D .I t w a s a n a l y z e d t h a t m e t h o d s t o e x t r a c t D N A t e m p l a t e a n d d i f f e ren t i n g re d i e n t h a d e f f e c t s o n R A P D . T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e b e s t re a c t i o n s y s t e m i s : D N A ( 2 5 -5 0
7、 n g ) , M g C l a c o n c e n t r a t i o n ( 2 . O m m o 1 / L ) , p r i m e r ( 1 5 - 4 5 n g ) , d N T P( 0 . 2 m m o l / L ) , T a q P o l y m e - r a s e ( 1 . 0 .1 . 5 U ) a n d t h e l a s t r e a c t i o n P r o c e d u r ei s t h a t t h e r e a c t i o n P r e一 d e n a t u r e d D N A a t
8、 9 4 Cf o r 5 m i n , d e n a t u r e d D N Aa t 9 4 C f o r 4 0 s e c , a n n e a l e d p r i m e r s a t 3 7 1C f o r 4 0 s e c , e x t e n d e d p r i m e r sa t 7 2 0 C f o r 9 0 s e c , r e - e x t e n d e d r e a c t i o n a t 7 2 C f o r 7 m i n。T h e v a r i e t y h o m o g e n e i ty w a s
9、i d e n t i f i e d a n d t h e P a re n t a l P o l y m o r p h i s m s w e re a n a l y z e d . T h e P a p e r i d e n t i fi e d t h e h o m o g e n e i ty o f t h e P a re n t s e e d s a n d t h e h y b r i d s e e d s a n d a n a l y z e d t h e P o l y m o r p h i s m s o f t h e P a re n t
10、s b e f o r e s c ree n i n g t h e P r i m e r s . T h e r e s u l t s w e re t h a t t h e re w e r e n o f a l s e s e e d s i n P a re n t s e e d s 勿 u s i n g t h e p r i m e r S 6 1 a n d S 1 0 0 2 .T h e P r i m e r s , w h i c h w e re s u i t a b l e f o r t h e P u r i ty i d e n t i fi c
11、 a t i o n o f c a p s i c u mh y b r i d s e e d s , w e re s c r e e n e d a n d t h e f i n g e r p ri n t s o f R A P D w e re e s t a b l i s h e da m o n g t h e P a re n t s a n d t h e i r h y b r i d s e e d s i n c a p s i c u m . 6 P r i m e r s w e r e s c r e e n e df r o m 1 0 0 : t h
12、e r e w e r e 2 P r i m e r s o f p a r t i a l f e m a l e ty p e ( S 1 0 , S 3 2 0 ) , 2 P r i m e r s o fP a r t i a l m a l e ty p e ( S 6 1 、S 7 4 ) ，2 P r i m e r s o f c o m p l e m e n t a r y ty p e ( S 1 0 0 2 、S 3 0 1 ) . U s i n g t h e p r i m e r 5 1 0 0 2 ,w e c a n f o u n d t h a t
13、t h e P a re n t a l s e e d w e re a l lp u re a n d t h e r e w e r e 5 f a u l t s e e d s ( 2 , 7 , 3 6 , 6 2 , 6 5 ) i n h y b r i d s e e d s .A s a re s u l t , t h e P a p e r s h o w s t h a t R A P D c a n b e a p 川 i e d t o P u r i ty i d e n t i fi c a t i o n o f t h e c a p s i c u m
14、s e e d s a n d t h a t R A P D h a s g o o d re l i a b i l i ty a n da c c u r a c y a f t e r t h e rea c t i o n s y s t e m a n d t h e r e a c t i o n P roc e d u re a re e s t a b l i s h e d .K e y w o r d : c a p s i c u m, R A P D , T h e p u r i ty i d e n t i fi c a t i o n , D N A独创性声明本
15、人声明所呈 交的学 位论文， 是本人 在导 师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知， 除了 文中 特别加以 标注的和 致谢的地方外， 论文中不 包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得湖南农大或其他教育机构的学位或证书而用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献已在论文中作了说明并表示感谢。研 究 生 签 “ : 卜 人 ha 间 : 。 年 妇 一拍学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解湖南农大有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国 家有关部门 或机构送交论文的复印 件和磁盘， 允许论 文被查阅和借阅。本人授权湖南农大可以将学位论文的全部或部分
16、内容编入有关数据库进行检索， 可以 采用影印、 缩印 或扫描等复 制手段保存、 汇编学 位论文。( 保留 的学位论文在解密后使用本授权书)研 究 生 签 名 : 卜 人导 师 签 “ ; 钊 I .Z a私 日 期 ; Dj 年 月 令 日日 期 : 。 r 年 月弘日第一章 前言辣 ( 甜) 椒别名番椒、 海椒、 秦椒、川椒、 青椒、辣子、辣茄、 椒茄等，系茄科辣椒属 ( 染色体2 N = 2 4 ) ，原产中南美洲于1 5- 1 6 世纪传入我国，以浆果供人们食用， 是一种重要的茄果类蔬菜作物和调味品， 果实内含有丰富的维生素C ,蛋白质、 糖类等营养物质，深受人们的喜爱。辣椒单叶、互生、叶片卵圆形、 无缺裂。 花单生或簇生、白或淡紫色。 果未熟时多为青绿色， 成熟后一般为红或橙黄色。 辣椒在温带地区为一年生草本蔬菜， 在热带地区则为多年生木本植物， 世界许多国家都栽培辣椒。 辣椒中含有的茄红素是人工提取红色素的主要原料， 作为着色剂被广泛应用，中国是世界上最大的辣椒种植国，2 0 0 2年产量占世界总产量的 3 9 . 2 % . “ 十五”期间辣椒育种
