妊娠期间母体巨噬细胞抗原提呈功能的改变及意义

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1、妊娠期间母体巨噬细胞抗原提成功能的改变及意义妊娠期间母体巨噬细胞抗原提呈功能的改变及意义导师 指导老师研究生曹泽毅教授李尚为教授韩字研教授谭宗建摘要目的研究妊娠期间母体巨噬细胞抗原提呈功能变化的情况及其对母体T h l T h 2 免疫偏倚的影响，以及自然流产妇女蜕膜巨噬细胞抗原提呈功能的变化。方法建立g a l b c 近交系小鼠的妊娠模型，无菌获取孕晚期B a l b c 小鼠髀，分离脾脏巨噬细胞，以动情期小鼠作为对照。通过诱导迟发超敏反应的方法检测巨噬细胞在体内使初始T 细胞致敏的能力和淋巴细胞抗原特异性转化实验检测巨噬细胞体外诱导致敏T 细胞增殖的能力，并采用流式细胞技术检测C D 4

2、 、C D 8 、I L l O 和I F N Y 在反应后的T 细胞中表达的情况。同时利用人群中接种卡介苗后形成的免疫记忆，采用游巴细胞体外抗原特异性转化实验检测被P P D 激发的自然流产患者蜕膜巨噬细胞诱导外周血致敏T 细胞增殖的情况，并加入不同浓度的孕激素，观察其对蜕膜巨噬细胞的影响。四川大学博士论文结果将充分摄取和结合了H G G 或P l a A g 抗原的孕晚期B a l b c 小鼠脾脏巨噬细胞注射到动情期小鼠腹腔使之致敏，再用相同抗原注射到小鼠足底诱发的迟发超敏反应强度显著低于动情期小鼠( P 0 0 5 ) ，提高P 浓度并不增加其抑制效应。结论孕晚期B a l b C 小

3、鼠脾脏巨噬细胞的抗原提呈功能显著受到抑制，而且在体外可诱导母体T 细胞的T h l O 。0 5 ) b u tt h ei n h i b i t i n ge f f e c t so f Pd i dn o tb o o s tw h e nPc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d 4妊娠期间母体巨噬细胞抗原提成功能的改变及意义C o n c l u s i o nT h ea n t i g e np r e s e n t i n ga b i l i t yo fs p l e e nm a c r o p h a g ef r o m

4、B a l b cm o t l s ei si n h i b i t e dd u r i n gl a t ep r e g n a n c y ，a n di n d n c e dt h em a t e r n a lT hl ，置于D o u n c e匀浆器中匀浆1 5 m i n ，所得匀浆在3 0 0 0 r p m 离心l O m i n ，上清液以0 2 2pm 滤器过滤除菌，收集所获液体，福林一酚法测定蛋白含量，调定浓度为l m g m l ，2 0 保存备用。2 2 2 脾脏巨噬细胞的制备( 1 )分别处死孕晚期( 孕1 5 d ) 和动情期( 对照组) B a l

5、 b C 雌鼠，无菌取脾，剔除血管和结缔组织，放入冷H a n k s 液中，剪碎，2 0 0目细胞筛上，轻轻研磨，收集细胞悬液。( 2 )加入终浓度为0 ，2 5 的胰酶，3 7 。C 水浴3 0 m i n ，制成单细胞悬液。( 3 ) 0 1 6 M 的T r i s - N H , C L 溶解红细胞。( 4 ) H a n k s 液，1 0 0 0 b p m 离心5 m i n ，弃上清夜，共3 次，洗去细胞碎片，显微镜下记数。( 5 )按1 0 7 个细胞7 0 c m 2 的比例置于玻璃培养瓶中，3 7 。C 贴壁l h ，去除未贴壁细胞，用4 “ C 冷H a n k s

6、液反复冲洗并收集贴壁细胞，苔判蓝染色( 见图1 0 ) ，鉴定活细胞在9 5 以上。( 6 )R P M l l 6 4 0 完全培养液( 1 0 灭活小牛血清) ，调定浓度为8 1 0 6+m l 。2 2 ，3 迟发超敏反应( D T H ) 的诱导妊娠期间母体巨噬细胞抗原提成功能的改变及意义抗原性物质经A P C 细胞加工处理后，能以抗原肽：M I - l C I I I 类分子复合物的形式表达于A P C 表面，使具有相应抗原受体的T 细胞增殖、分化为效应T 细胞和记忆T 细胞，当抗原特异性记忆T 细胞再次与相应抗原接触时，可迅速分化为效应T 细胞，并引发炎症反应，即D T H 反应。

7、本部分实验利用体内迟发超敏反应( D T H ) 检测孕晚期小鼠脾脏巨噬细胞在体内使初始T 细胞致敏的能力。( 1 )在分离的巨噬细胞中加入终浓度为5 0ug m 1 的H G G A g 或P 1 a A g ，3 7 。C 共同孵育4 小时，使巨噬细胞充分摄取、加工和表达抗原后被激发。( 2 ) H a n k s 液5 m l ，1 0 0 0 b p m 离心5 m i n ，弃上清夜，共3 次，洗去未结合抗原。( 3 )将l m l 经抗原激发的巨噬细胞注入动情期小鼠腹腔，浓度分别为I 1 0 4 m l 、l 1 0 5 l 、l 1 0 6 m l 。( 4 )1 4 d 后在这

8、些小鼠的左足底分别注入H G G A g 或P l a - A g l 0 0pm l溶液( 各含胎盘抗原和H G G 抗原5 0 ug ) ，右侧足底注射i 0 0um l的H a n k s 液。( 5 ) 4 8 h 后用游标卡尺( 精度0 0 2 m m ) 分别测量左右足垫的厚度，以左足垫厚度减去右足垫厚度的差值计算水肿反应，以此反映D T H反应的强度。2 3 体外淋巴细胞转化实验( M T T 法)抗原性物质经A P C 细胞提呈给T 细胞，使具有相应抗原受体的T 细胞发生克隆扩增，分化为效应T 细胞和记忆T 细胞，当抗原特异性记忆T 细胞在体外再次与相应抗原接触时，可迅速增殖、

9、分化为效应T 细胞，即为淋巴细胞抗原特异性转化实验。M T T 法是利用活细胞代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶能还原四甲基四川大学博士论文偶氮唑盐( M T T ) ，成蓝色不溶于水的甲瓒结晶( 见图1 4 ) ，甲瓒经二甲亚砜溶解后，在5 7 0 n m 波长具有最大吸收值。细胞死亡后，失去还原M T T的能力。活细胞的数量和功能状况，与甲瓒形成的多少成正比。本部分实验利用上述原理检测抗原激发的巨噬细胞体外诱导被相同抗原致敏的T 细胞增殖的能力。2 3 1M T T 液的制备将5 m g M T T 溶于l m l H a n k s 液中，0 2 2um 滤器过滤除菌，现用现配。2 3 2 致

10、敏T 细胞的制备给正常B a l b C 雌鼠足底分别注射与完全弗氏佐剂( c F A ) 。混合的H G G A g 或P l a A g l 0 0um l ( 含H G G A g 或P l a A 9 5 0ug ) ，获得致敏小鼠，9 d 后无菌取胭窝淋巴结，放入冷H a n k s 液中，剔除多余脂肪和结缔组织，2 0 0 目细胞筛上研磨，制成细胞悬液，并通过尼龙毛柱，从洗脱液中收集的细胞富含T 细胞雪，显微镜下记数。完全弗氏佐剂( C F A ) 的配制：石蜡油( 2 份) + 羊毛脂( 1 份) + 2 0 m g 卡介苗，充分混合后，1 2 0，1 2 M p a ，灭菌3

11、0 m i n 备用。尼龙毛柱分离T 细胞：( 1 ) 尼龙毛放入烧杯内，加双蒸水煮沸l O m i n ，置于漏斗滴干，重复6次，最后2 次用去离子水。( 2 ) 将O 6 9 尼龙毛( 约可以分离1 1 0 8 个细胞) 撕开、梳整，装入5 m l注射器，尼龙毛在注射器内的刻度数为4 m l ，1 2 0 ，1 2 M p a ，灭菌3 0 r a i n 。( 3 )以预温的全培养液浸润全柱，关闭阀门，3 7 “ C 的孵箱放置3 0 m i n 。( 4 ) 用H a n k s 液和R P M l l 6 4 0 培养液各5 m l 洗柱，流速0 2 m l s e c 。( 5 )

12、将含有l 1 0 8 的淋巴结细胞悬液1 5 m l 装入柱内，关闭阀门，3 7妊娠期间母体巨噬细胞抗原提成功能的改变及意义孵育6 0 m i n 。( 6 )用预温的含2 0 灭活小牛血清( F C S ) 的R P M I l 6 4 0 洗柱5 m l 洗柱2 次，流速为1 滴s e c 。O 0 5 ) ；当终浓度为41 0 6 m l 和8 1 0 5 m l 时则显著低于动情期小鼠( P O 0 5 ，见表3 ) 。以P L A A g 作为抗原褥到的结果与此相同( 见表4 ) 。表3H G G 抗原体外诱导致敏T 细胞增殖的情况G r a p h 3P r o l i f e r

13、 a t i o ni n d u c e db yH G Ga n t i g e no fTc e l lp r i m e db ys ea n t i g e ni nv i t r o2521 5H 10 502 E 5 m l4 E 5 m l8 E S m l c o n c e n r e a t i o no fm a c r o p h a g e四川大学博士论文表4P l a - A g 抗原体外诱导致敏T 细胞增殖的情况G r a p h 4P r o l i f e r a t i o ni n d u c e db yP 1 8 _ A ga n t i g e n

14、o fTc e l lp r i m e db ys ea n t i g e ni nv i t r o25215H” 10502 E 5 m l4 E 5 m l8 E 5 m lc o n c e n t r t i o no fm a c r o p h a g e2 巨噬细胞H 2 D 。分子和T 细胞C D 4 、C D 8 分子的表达H 2 D 4 分子是B a l b c 小鼠的M H C I I 类分子，是A P C 细胞能否提里抗原的关键。本研究发现，H 2 D 分子在孕晚期和动情期小鼠的脾脏巨噬细胞表面均有较高表达，二者差异无显著性( P 0 0 5 ) ；C D 8 +

15、 T 细胞则显著低于孕鼠脾脏巨噬细胞作为A P c ( 见表5 ，P O 0 5 ) 。、表5 巨噬细胞H 2 D 4 分子和T 细胞C D 4 、C D 8 分子的表达T a b l e5E x p r e s s i o no fH 2 D dm o l e c u l eo 8 c r o p h a g ea n d C D 4a n dC D 8m o l e c u l eo nTc e l G r o u p sM a c r o p h a g e sTc e i lH 2 D “C D 4C D 8E s t r o u s7 5 6 1 8 9 9 69 2 4 1 8 6

16、 1 4 2 8 9 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ：! 圭! ! ：! ! ：! ! ：! 圭! ! ：! ! ：塑：! 圭! ! ：! ! ：p O 0 5w h e nc o m p a r e dw i t hE s t r o u sg r o u p sp O 0 5 ) 。四川大学博士论文中娑驾里峨哕 ：誓 夕”1l易厂【三；髟1 d2 d3 d4 dT i e ( d )讨论1 孕期母体脾脏巨噬细胞抗原提呈功能的改变由于胚胎所具有的抗原性，妊娠期间母体要产生一系列的免疫免疫变化才能适应胚胎的种植、生长和发育。长期的临床实践发现，妊娠期间母体合并麻风、结核、弓形虫、疟疾和肿瘤等疾病时往往迁延不愈甚至恶化，而合并类风湿性关节炎这一类由细胞免疫介导的疾病时则常常缓解，提示正常妊娠期间母体的细