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1、山东农业大学硕士学位论文月季黑斑病菌蔷薇盘二孢（Marssonina Rosae）形态多样性、 致病性多样性和遗传多样性研究姓名：刘宝军申请学位级别：硕士专业：园林植物与观赏园艺指导教师：赵兰勇;刘振宇20090505山东农业大学硕1 ：学位论文中文摘要2 0 0 7 2 0 0 8 年，从中国北京、河南、陕西、山东、湖北、安徽、浙江、江西、重庆、福建、广东等地采集蔷薇属植物黑斑病的发病叶片共计6 1个样本，尽量覆盖了中国地域的东部、中部和南部，寄主包括蔷薇属植物的月季、玫瑰、蔷薇、黄刺玫。从中分离纯化得到了2 2 个蔷薇盘二孢菌的分离物。通过测定发现，6 1 个样本病原菌分生孢子的大小差异明
2、显。其中分生孢子的大小、菌落颜色和生长速率三者之间存在如下关系：长的分生孢子( L 1 8 0um ) 一般形成( 淡) 黄色的菌落，短的分生孢子( L 1 8 O t m ) c o u l df o r my e l l o wc o l o n i e s ，s m a l l e rc o n i d i a ( L 7 5 。中国栽植月季的历史最为悠久，种植的地域极为广阔，地理条件差异悬殊，这都是病菌产生致病性变异的有利条件，但国内有关这方面的研究尚属空白。近年来，月季已被北京等若干大城市选为市花，品种的引进和选育工作正迅速开展。研究我国月季黑斑病菌地区间的致病性差异，将为提高月季的
3、抗病性、减少药剂防治，促进城镇绿化的发展提供科学依据。2 蔷薇盘二孢菌的研究进展2 1 月季黑斑病的病原菌月季黑斑病的病原菌是蔷薇盘二孢( M a r s s o n i n ar o s a e ( L i b ) F r ) 异名为蔷薇放线孢似c t i n o n e m ar o s a e ( L i b ) L i n d ) 。有性阶段为蔷薇双壳菌( D i p l o c a r p o nr o s a eW o l f ) ，菌丝在寄主角质层与表皮细胞间生长，以垂直分枝穿过细胞壁，进入细胞内，形成吸器来吸收营养。分生孢子盘生于角质层下，初埋生，后突破表皮，圆形至不规则形，黑
4、色，直径1 0 8 “ 1 9 8 9 m ，盘下有呈放射状分枝的菌丝。分生孢子梗无色，极短，不明显。分生孢子长卵圆形或近椭圆形；无色，双胞，分隔处略缢缩，2 个细胞大小不等，略弯曲，大小为1 8 “ - - 2 5 2 5 4 6 5 1 t m 。该菌在有性阶段其子囊盘生于越冬病叶的表面，球形至盘形，深褐色，裂口辐射状；子囊圆筒形，子囊孢子长椭圆形，有一个隔膜，两个细胞大小不等，一般不易见到蔷薇盘二孢的有性阶段，仅在少数地方有报道，其有性阶段的再结合也没有被很好地阐明。蔷薇盘二孢菌的分生孢子盘主要在叶片、嫩枝、叶柄和茎上形成，并且逐步发展的现象已在感病的叶片上发现。在蔷薇盘二孢和蔷薇属植物
5、之间的关系中，分生孢子盘在细胞内菌丝发展后期被观察到，分生孢子盘形成的最初标志是每隔一段距离沿着角质层下菌丝呈指状发射，呈指状发射的菌丝细胞较短并能形成密集的网状菌丝，然后就变成了分生孢子盘的底部。等达到预期的大小后，网状菌丝的细胞向上生长后分割溢缩成双孢或者单孢( 大型分生孢子和小型分生孢子) 的产孢细胞，双孢的分生孢子被山东农业大学硕二卜学位论文隔膜分成两个孢子，隔膜将分生孢子从分生孢子梗处分开比分成双孢要早。较窄的或者较尖的细胞靠近于分生孢子梗，圆头细胞朝上，分生孢子梗较短并具有单一的分生孢子，小型分生孢子一端膨大，并从分生孢子梗上形成，分生孢子成队的推动表皮向上并形成一个圆顶状结构即分
6、生孢子层。大型分生孢子和小型分生孢子可能出现在相同的分生孢子层内，成熟的分生孢子层在当相对湿度低于1 0 0 时能够释放大量分生孢子。其有性孢子即子囊孢子，着生于分生孢子盘上，子囊孢子很少见，这主要归因于缺乏有利于它们发展的气候条件，如果气候条件有利于子囊果的形成，子囊果包含子囊在春天可以看到，但如果气候条件不合适，果状物就变成了充满分生孢子的分生孢子盘，因此促进了病原菌的无性生活周期。病原菌在寄主体内分泌毒素，杀死和分解寄主细胞，致使叶面产生黑褐色坏死斑，同时还产生乙烯和脱落酸，导致病叶大量脱落。2 2 蔷薇盘二孢菌的侵染机制由子囊菌亚门蔷薇盘二孢菌引起的月季黑斑病是一个广泛分布的具有破坏性
7、的病害。尽管近几年在月季黑斑病的管理上已取得巨大的进步，但是对于病原菌如何侵染月季、在寄主上扩展仍不明确，没有合适的理论体系去解释其侵染机制，不能有效的控制月季黑斑病的侵染。探索性研究到目前为止，关于蔷薇盘二孢菌已经获得一些方面的研究结果，研究涉及了病原菌在寄主上和外界环境中的萌发问题、病原菌在月季细胞侵染周期的超显微结构、病原菌的侵染机制、在寄主细胞上形成的不同病原菌的结构及随着时间的流逝病原菌保持生存能力和致病性的最佳条件。在过去的6 0 年内关于该病原菌的细节性研究已经完成。了解影响蔷薇盘二孢感病和发展的因素对于其有效控制是非常重要的，已有报道从不同寄主上得到的病原菌的最佳生长条件有差别
8、，发现最广泛的繁殖体是双孢的分生孢子。D r e w e s A l v a r e z ( 2 0 0 3 ) 发现分生孢子在O 3 3 都可以萌发，但是G a c h o m o ( 2 0 0 5 ) 等认为病害症状在1 0 以下几乎不能形成；P a l m e r ( 1 9 6 2 )等认为病害症状的发展在持续的2 9 5 以上的高温会受到抑制：H o r s t( 1 9 8 3 ) 发现孢子萌发、菌丝生长和病害发生的最适温度分别是1 8 、2 1 、2 4 ，但是J e n k i n s ( 1 9 9 5 ) 发现从不同寄主上分离得到的病原菌的最佳产孢温度有差别。G a c
9、h o m o ( 2 0 0 5 ) 等发现，尽管病原菌可以在1 5 2 79月季黑斑病菌蔷薇盘_ 二孢( M a r s s o n i r t ar o s a e ) 形态多样性、致病性多样性和遗传多样性研究下生长，但是与高温条件相比，病害的发生在1 5 会非常缓慢，当水分条件足够，在低温下病原菌就能够形成侵染寄主的机制，然后逐步发展，温度升高到最适温度时病害形成。当然这并非最新发现，B r e e s e 等( 1 9 9 4 )和A e g e r t e r 等( 2 0 0 3 ) 先后在灰霉病的病原菌中发现这种现象。相对湿度已经被证明在黑斑病的发生过程中起着非常重要的作用，A
10、 r o n e s c u ( 1 9 3 4 ) 发现分生孢子只有在先放在湿气环境中1 5 小时后才能够形成感病，P a l m e r 等( 1 9 7 8 ) 发现不管相对湿度多少，成熟的无性孢子只有被浸入水中才能够形成感病。在相对湿度为9 0 以下，分生孢子只有浸入水中6 h 以上或者是在相对湿度为1 0 0 条件下至少5 m i n 才能够感病。孢子萌发率会随着浸入水中的持续时间的延长而升高，在没有预先浸入水中且高湿度环境下，孢子萌发主要取决于表面水蒸气的冷凝和水汽的浓缩。除此之外，蔷薇盘二孢的是否形成感病还与p H 关系密切，J e n k i n s( 1 9 9 5 ) 发现
11、在p H 3 6 6 6 条件下，分离到的不同病原菌生长明显不同，在p H 4 8 5 4 条件下生长最佳，p H 7 0 几乎不生长。蔷薇盘二孢能够在不同培养基上生长良好但很慢，如麦芽、酵母、马铃薯葡萄糖、琼脂等培养基上。尽管从不同寄主上分离到的病原菌可以在含有琼脂的不同培养基上生长，但是在P D A 更有利于其培养。病原菌在储藏过程中毒性下降，F r i c k ( 1 9 4 4 ) 报道病原菌在培养基上培养能够丧失致病性；P a l m e r ( 1 9 6 6 ) 发现在培养基上，1 2 下纯培养1 3 个月或者叶片上保存l O 个月，其致病性能够降低但活性并未完全丧失；K n i
12、 g h t 等( 1 9 7 8 ) 报道在2 1 5 下，大部分蔷薇盘二孢的孢子在感病叶片上保存接近1 年仍具有致病性；D r e w e s A l v a r e z ( 1 9 9 2 ) 发现在2 3 “ ( 2 含麦芽的琼脂培养基上培养5 - 6 个月其致病性出现明显下降；在2 0 下，感病的叶片保存病原菌是比较合理的，为了获得新的接种体而不至于丧失致病性，可以每6 个月利用冷冻的接种体去接种健康的植株。频繁的融化和冷冻带有病原菌的材料应该避免，因为那样能加快其致病性的丧失。A r o n e s c u 等( 1 9 3 4 ) 发现，一个分生孢子一般只形成一个芽管，但是也有的
13、能形成3 个芽管，芽管主要出现在孢子的一个细胞上，但偶然的也会出现在两个细胞上，甚至是在隔膜的附近；W i g g e r s 等( 1 9 9 7 ) 发现芽管在长度上有变化，芽管末端在形成穿透钉之前形成的附着孢也有所不1 0山东农业大学硕士学位论文同，明显的附着孢并不一定能形成；G a c h o m o 等( 2 0 0 5 ) 发现一些芽管只是在末端简单的膨胀，有些芽管直接穿透寄主表皮并不形成附着孢。A r o n e s c u 等( 1 9 3 4 ) 认为蔷薇盘二孢长长的芽管不能够形成附着孢并且可能永远都无法穿透寄主的表皮，因为这需要损耗大量的能量。有关蔷薇盘二孢方面已经开展了很
14、多研究，如在不同栽培品种上分生孢子的萌发、环境对于孢子萌发和病害症状发展的影响因素、月季不同栽培品种上的抗病性以及它们可能的抗病机制。A r o n e s c u 等( 1 9 3 4 ) 推测蔷薇盘二孢通过机械力侵染月季叶片，近期G a c h o m o 等( 2 0 0 5 ) 提出一些病原菌侵染叶片的可能的机制，那就是通过机械力和酶的结合作用来侵染叶片。2 3 蔷薇盘二孢菌的生理小种的研究国外研究证明：在条件不同的地区，月季黑斑病菌和当地品种在长期适应的过程中，致病性产生了地理差异。J e n k i n s ( 1 9 5 9 ) 将同一来源的月季品种种植在美国不同地区，感病性表现
15、出差异，认为是各地病原菌的致病性不同所致，并首先提出该菌有地理小种的看法。P a l m e r ( 1 9 6 6 ) 采集了美国七个地区的菌种，接种一系列月季品种，证明北部地区菌种的致病性强于南部地区的菌种。S v e j d a ( 1 9 8 6 ) 用一系列品种测定3 个不同来源的菌种，证明它们是3 个致病性各不相同的小种。蔷薇盘二孢生理小种的发生已经被广泛报道，所有病原菌的分离物都没有引起相同的感病程度，所有的蔷薇属植物对于同一种病原菌分离物也没有作出相同的反应，国外研究也表明蔷薇属植物的种和栽培种对黑斑病的易感病程度不同可能是因为病原菌在不同地区生理小种的出现，P a l m e
16、 r( 1 9 6 6 ) 发现从2 种不同蔷薇栽培种上获得的蔷薇盘二孢的分生孢子，在相同条件下生长，最终获得毒力不同的接种体，这表明了不同小种的存在；D r e w e s A l v a r e z ( 1 9 9 2 ) 根据它们的菌落特征描述了2 种形态学小种：紧凑型和星形。A l i 等( 2 0 0 0 ) 根据颜色观察到3 种菌落：黄色菌落，咖啡色菌落和茶青色菌落，他们发现在菌落颜色和孢子大小之间存在一定关系，长的分生孢子和淡黄色的菌落、短的孢子和黑色菌落联系在一块；D e b e n e 等( 1 9 9 8 ) 利用一系列细微的指标鉴定出至少5 种蔷薇盘二孢的生理小种；Y o k o y a 等( 2 0 0 0 ) 根据不同植物材料在蔷薇盘二孢的分离物中鉴定出4 种病变型，由于是2 个研究团队，又根据许多蔷薇盘二孢的特月季黑斑病菌蔷薇盘二孢( M a r s s o n i n ar o s a e ) 形态多样性、致病性多样性和遗传多样性研究征和不同植
