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1、重庆医科大学博士学位论文COMT与蛛网膜下腔出血后早期脑血管痉挛的相关性研究姓名：何朝晖申请学位级别：博士专业：外科学（神经外科学）指导教师：孙晓川20090401重庆医科大学博士研究生学位论文C O M T 与蛛网膜下腔出血后早期脑血管痉挛的相关性研究摘要第一部分实验性蛛网膜下腔出血后早期大鼠C O M T 表达的变化及意义目的观察实验性S A H 后早期大鼠C O M T 的m R N A 和蛋白表达、血浆C A 含量、基底动脉管径和管壁厚度的变化规律，探讨S A H 后早期大鼠C O M T 表达变化的意义。方法以视交叉前池单次注血法构建大鼠S A H 模型。采用R T - P C R法
2、、W e s t e r nB l o t t i n g 法检测大鼠S A H 后早期各个时相点( S A H 后6 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h ) 纹状体组织内C O M T 的m R N A 和蛋白表达。采用高效液相色谱法测定大鼠相应时相点血浆C A 含量。H E 染色后测量大鼠相应时相点基底动脉管径和管壁厚度。结果假手术组大鼠C O M T 的m R N A 和蛋白表达与正常对照组比较无统计学差异( P O 0 5 ) 。与正常对照组和假手术组比较，S A H 组大鼠在建模后6 h 见C O M T 的m R N A 和蛋白表达开始增高( P O 0 5
3、 ) 。假手术组大鼠血浆C A 含量与正常对照组比较无统计学差异( P O 0 5 ) 。S A H 组大鼠在建模后6 h 即见血浆C A 含量升高，2 4 h 时达到峰值，2 4 h 后开始下降，至7 2 h 后仍高于正常对照组和假手术组相应时相点水平。各时相点C A 含量与正常对照组和假手术组相应时相点比较均有统计学差异( P O 0 5 ) 。与正常对照组和假手术组比较，S A H 组大鼠在建模后6 h 基底动脉的管径开始缩小，管壁开始增厚，但变化无统计学差异( P O 0 5 ) ；建模后1 2 h ，基底动脉的管径缩小和管壁增厚进一步加重( P 0 0 5 ) 。结论( 1 ) 实验
4、性S A H 可以诱导S A H 后早期大鼠纹状体C O M T表达增高。( 2 ) 实验性S A H 后早期C A 含量明显升高并伴有C V S 发生。( 3 ) S A H 后早期C V S 和血浆C A 含量增高可能与S A I d 后早期C O M T表达增高不够充分和持久有关。第二部分p A d x s i G F P r C O M T 重组腺病毒载体的构建、包装、扩增、纯化目的构建A d G F P r C O M T 重组腺病毒载体体系，为研究C O M T基因转染提供材料。方法扩增得到目的基因片段克隆到p G E M TE a s yV e c t o r 上，得到4萤厌医科
5、大学博士研冤生字位论又r C O M T - T 克隆载体。从r C O M T - T 克隆载体上E c o R I 酶切得到r C O M T基因，连接到p S h u t t l e G F P C M V 载体，得到p S h u t t l e G F P r C O M T 。将p S h u t t l e G F P r C O M T 转移至p A d x s i 载体上，得到A d G F P - r C O M T病毒质粒。A d G F P r C O M T 质粒经P a cI 酶切、酚氯仿抽提、乙醇沉淀后，脂质体介导转染2 9 3 T 细胞。将重组腺病毒大量扩增，然
6、后用C s C l 密度梯度超离心法进行纯化，加入1 0 灭菌甘油，分装后8 06 C 保存备用。结果酶切和P C R 鉴定证明r C O M T - T 克隆载体质粒、重组穿梭载体质粒和重组腺病毒载体质粒完全正确，并能在2 9 3 T 细胞中融合表达。结论成功构建A d G F P r C O M T 重组腺病毒载体体系，并成功转染2 9 3 T 细胞，为研究C O M T 基因转染奠定了基础。第三部分p A d x s i G F P r C O M T 重组腺病毒转染对S A H 大鼠C O M T 表达的影响目的探讨基因转染对实验性S A H 后早期大鼠C O M T 表达、血浆C A
7、 含量及基底动脉管径和管壁厚度的影响。方法以视交叉前池单次注血法构建大鼠S A H 模型。建模后即刻采用立体定向技术在S A H 模型大鼠的纹状体内注射p A d x s i G F P r C O M T 重组腺病毒。采用R T - P C R 法、W e s t e r nB l o t t i n g 法检测转染后各个时相点( 转染后6 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h ) 纹状体组织内C O M T 的m R N A 和蛋白表达。采用高效液相色谱法测定大鼠相应时相点血浆C A 含量。H E 染色后测量大鼠相应时相点基底动脉管径和重庆医科大学博士研究生学位论文管
8、壁厚度。结果转染后6 h 腺病毒注射组大鼠纹状体组织中C O M T 的m R N A和蛋白表达开始增高，但与S A H 组、空载体注射组比较无明显统计学差异( P O 0 5 ) 。自转染后1 2 h 开始C O M T 的m R N A 和蛋白表达增强更加明显，于2 4 h 时达到峰值，2 4 h 后开始下降直至转染后7 2 h ，各时相点表达水平均明显高于S A H 组和空载体注射组相应时相点水平( PO 0 5 ) 。自转染后1 2 h开始血浆C A 含量升高更加明显，并于转染后2 4 h 达到高峰，转染后2 4 h 开始下降，至4 8 h 时下降更加明显，至7 2 h 时已降至接近正
9、常水平，各时相点C A 含量与S A H 组和空载体注射组相应时相点水平比较均有明显降低( P 0 0 5 ) 。转染后1 2 h ，基底动脉的管径缩小和管壁增厚进一步加重，至转染后2 4 h 最明显并持续至4 8 h ，但各时相点与S A H 组和空载体注射组相应时相点比较均有明显改善( P 0 0 5 ) 。结论( 1 ) p A d x s i G F P r C O M T 重组腺病毒可明显增强转染后早期( 转染1 2 h 后) 各个时相点C O M T 表达水平，且高表达持续时间更长。( 2 ) 与S A H 组和空载体注射组比较，转染1 2 h 后各时相点血浆重庆医科大学博士研究生
10、学位论文C A 含量明显下降，C V S 明显缓解。( 3 ) 转染后血浆C A 含量下降及C V S 缓解可能与重组腺病毒所诱导的C O M T 表达进一步增强有关。( 4 )再次证实了实验性S A H 后早期C V S 和血浆C A 含量增高与S A H 后早期C O M T 表达增高不够充分和持久的相关性。第四部分C O M T 基因多态性与S A I l 后早期C V S 的相关性分析目的探讨C O M T 基因多态性与S A H 后早期C V S 的相关性。方法搜集重庆医科大学附属第一院神经外科2 0 0 8 年1 月至2 0 0 8年1 2 月收治的自发性S A H 急性期( O
11、0 5 ) A f t e rS A Hm o d e l i n g ，C O M Te x p r e s s i o ni nr a t si nS A Hg r o u pb e g a nt or i s ea t6 h ，r e a c h e dp e a ka t12 h ，t h e nd e c r e a s e dc o n t i n u a l l ya t2 4 ha n d4 8 h ，r e t u r n e dc l o s et ot h el e v e lo fc o n t r o lg r o u pa t7 2 h T h ee x p r e
12、 s s i o n so fC O M Ta t6 h ，12 h , 2 4 h , 4 8 ha f t e rS A Hw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fc o n t r o lg r o u p ( P 0 0 5 ) A f t e rS A Hm o d e l i n g ，C Ac o n t e n ti nS A Hg r o u pb e g a nt or i s e6 ha R e rS A Ha n dr e a c h e dp e a ka t2 4 h , a n dd
13、e c r e a s e da f t e r2 4 ht o7 2 h T h ec o n t e n t si ne a c ht i m ep o i n t sw e r eh i g h e rt h a nt h a ti nc o n t r o lg r o u pa n dt h o s ei ns h a mo p e r a t i o ng r o u pa tc o r r e s p o n d i n gt i m ep o i n t s ( P O 0 5 ) C o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u pa n
14、ds h a mo p e r a t i o ng r o u p t h ec a l i b e rc o n s t r i c t i o na n dw a l lt h i c k e n i n ga g g r a v a t e do b v i o u s l y12 ha f t e rm o d e l i n g ( P 1 0重庆医科大学博士研究生学位论文0 0 5 ) C o n c l u s i o n ：( 1 ) I n c r e a s e dC O M Te x p r e s s i o nc a nb ei n d u c e di ne a
15、r l ys t a g ea f t e re x p e r i m e n t a lS A H ( 2 ) C Ac o n t e n t si n c r e a s e do b v i o u s l ya c c o m p a n y e dw i t hC V Si ne a r l ys t a g ea f t e re x p e r i m e n t a lS A H ( 3 ) C V Sa n di n c r e a s e dC Ac o n t e n t si ne a r l ys t a g ea f t e re x p e r i m e n
16、 t a lS A Hm a yb ea s s o c i a t e dw i t hi n s u f f i c i e n te l e v a t e de x p r e s s i o no fC O M T S e c t i o nt w o C o n s t u r c t i o n ，p a c k a g i n g ，a m p l i f i c a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fr e c o m b i n a t e dp A d x s i G F P - r C O M TO b j e c t i v e s ：T oc o n s t r u c tp A d x s i G F P - r C O M Tr e c o m b i n a t e da d e n o v i r u sv e c t o rs y s t e mf o rf u
