纤维素酶活力测定

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1、生化实验报告 1 山东大学实验报告 2011 年 4 月 20 日 姓名 张行润 系年级 2009 级生科 4 班 学号 200900140177 同组者 于潜 科目 生物化学实验 题目纤维素酶活力测定3,5-二硝基水杨酸法 仪器编号 105 一、 实验目的 1、 学会并掌握用 3、5二硝基水杨酸法测定酶活力方法 2、 巩固使用分光光度计 二、 实验原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括 C1 酶、CX 酶和-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中 C1 酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素， CX 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤 维寡糖，-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤

2、维素产生的纤 维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的 3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的 氨基化合物，在 550nm 波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度 呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力 的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活 力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位 时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物

3、往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是 从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应 速度较为合适。 本实验中酶活力定义：1mg 酶每分钟水解生成 1 微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。 由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。 三、 实验器材 （1）722 型分光光度计 （2）恒温水浴 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）分析天平 （7）试管架 （8）胶头滴管 （9）具塞比色管（25mL10） （10）移液管 （2mL；5mL） （11）烧杯 （500mL3） （12）洗耳球 四、 实验材料 （1）

4、 纤维素酶：0.05g 酶溶解定容至 50ml，取 1ml 再定容至 100ml 待测（用 PH4.5 乙酸- 乙酸钠缓冲液配制） ； （2） 3、5二硝基水杨酸显色液； （3） 05%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC） ：用 0.1mol/LPH4.5 醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置； （4） 标准葡萄糖溶液（1mg/mL） ； （5） 蒸馏水。 五、 实验操作 1. 空白管的测定： 生化实验报告 2 取 1 毫升酶液,沸水浴 5 分钟，冷却加 3 毫升 0.5%CMC； 2. 样品管测定： 取三支比色管，分别加入 0.5%CMC 3 毫升，酶液 1 毫升,混匀后与空白管一起于 50水 浴锅中水浴 3

5、0 分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸 10 分钟使酶失活,冷却加入 3 毫升显色液， 再 沸水浴 10 分钟，冷却后加蒸馏水定容至 25 毫升，混匀，与标准曲线同时于 550nm 处测 OD 值。 3. 标准曲线绘制： 取 6 只 25ml 比色管，分别吸取 0，0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0mL 的葡萄糖于,6 支试管 中,均用蒸馏水稀释至1mL,加3.5-二硝基水杨酸显色剂 3mL,在沸水浴中煮沸显色 10 分钟,冷 却,定容至 25ml。 在 550nm 处比色测其 OD 值。 以光密度为纵坐标， 以葡萄糖微克数为横坐标， 绘出标准曲线。 4. 计算酶活力： 在上述条件下，每分钟

6、催化纤维素水解生成微克葡萄糖的酶量定为一个活力单位。 N OD 值对应的葡萄糖量 纤维素酶活力单位 301 N-酶液的稀释倍数 30糖化所用时间 反应酶液毫升数 六、 注意事项 1. 实验中由于比色管中溶液量过多，若用旋窝搅拌器混匀，可能使溶液溅出，可使用保鲜 膜，将其覆盖在比色管口，上下摇动比色管，进行混匀； 2. 分光光度计使用前应进行预热 30min，使其发光稳定，且在无样品放置时，应使试样室盖 打开，此时光门自动关闭，以保护光电管； 3. 使用比色管时要将其擦拭干净，应用吸水纸吸去比色管表面溶液，用擦镜纸擦拭，以避 免对比色管光滑一面造成磨损。且测量时，不可以其磨砂面正对光源； 4.

7、在标准曲线制作时，应从低浓度到高浓度以此测量，因为低浓度的残留液对高浓度待测 液的测定不会有太大影响，所以可不用润洗比色管，但若有高浓度到低浓测定，则需要 对比色管进行润洗，以消除误差，因为高浓度残留液会对低浓度的溶液浓度造成很大影 响。 七、 实验结果 (一) 实验数据统计 表一 标准曲线的测定 管号 0 1 2 3 4 5 葡萄糖/mL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 显色液/mL 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 沸水浴中煮沸显色 10min,冷却,加蒸馏水定容至 25mL A(550nm) 0.

8、000 0.105 0.224 0.345 0.462 0.583 生化实验报告 3 表二 样品的测定 编号 空白 样品一 样品二 样品三 酶液/mL 1(失活) 1 1 1 CMC/mL 3 3 3 3 50恒温 30min 显色液/mL 3 3 3 3 沸水浴中煮沸显色 10min,冷却,加蒸馏水至 25mL A(550nm) 0.000 0429 0.433 0.428 (二) 图表分析 根据图表曲线拟合，由标准葡萄糖光吸收曲线所得公式为 y = 0.0005865x-0.0069，根 据三个样品管的 A （550nm） 值可得其葡萄糖含量为 743.2,750.0,741.5ug， 平

9、均得 744.9ug。 N OD 值对应的葡萄糖量 纤维素酶活力单位=（100744.9）/30=2483 ug/mgmin 301 则每克纤维素酶（固体）的活力单位数=24831000=2.48106 ug/gmin 八、 分析讨论 本次实验中有以下方面可能导致误差： 1. 定容到 25ml 后未充分混匀，导致上层溶液浓度偏低，进而影响 OD 值测量； 2. 使用比色杯时未充分润洗，影响测定； 3. 空白管在沸水浴时未完全失活，会导致调零基准不准确，影响实验结果； 4. 放入沸水浴是没有保证时间相同，会直接导致实验误差； 5. 定容时应使液体完全冷却，否则宜出现误差； 0 0.105 0.224 0.345 0.462 0.583 y = 0.0005865x-0.0069 -0.100.10.20.30.40.50.60.702004006008001000标标 准准 葡葡 萄萄 糖糖 光光 吸吸 收收 （ O D 值值 ）葡萄糖毫克数葡萄糖毫克数/mg 图一：标准葡萄糖光吸收曲线（图一：标准葡萄糖光吸收曲线（OD值）值） A(550nm) 标准葡萄糖光吸收曲线（OD 值）A（550nm） A(550nm)