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1、原生质体融合技术简介一一 原生质体融合原生质体融合n n定义定义：原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体。然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合接着发生两次基因组之间的接触、交换、遗传重组，在再生细胞中获得重组体。三三 原生质体融合的过程原生质体融合的过程 亲株甲乙原生质体融合体酶解融合再生再生筛选 优化n n 遗传标记亲株筛选遗传标记亲株筛选n n 原生质体制备原生质体制备n n 原生质体原生质体再生再生及再生频率计算及再生频率计算n n 原生质体的融合原生质体的融合
2、n n 异核体检出异核体检出 n n 重组体检出和鉴定重组体检出和鉴定n n重组体重组体的形态，生理生化和遗传分析的形态，生理生化和遗传分析 1 标记菌株的筛选标记菌株的筛选n n用于原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以用于原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以便于重组体的检出。常用营养缺陷型和抗性作为便于重组体的检出。常用营养缺陷型和抗性作为标记，也可以采用热致死，孢子颜色，菌落形态标记，也可以采用热致死，孢子颜色，菌落形态作为标记。实际时究竟采用哪种遗传标记，要根作为标记。实际时究竟采用哪种遗传标记，要根据实验目的来确定。如果原生质体融合的目的是据实验目的来确定。如果原生质体融合的目的是
3、为了进行遗传分析，那么应该采用带有隐性基因为了进行遗传分析，那么应该采用带有隐性基因的营养缺陷性或抗性菌株；如果从育种角度进行的营养缺陷性或抗性菌株；如果从育种角度进行原生质体融合，由于大多数营养缺陷性菌株都会原生质体融合，由于大多数营养缺陷性菌株都会影响代谢产物的产量，所以在选择营养缺陷性标影响代谢产物的产量，所以在选择营养缺陷性标记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的缺陷记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的缺陷性菌株性菌株 2 原生质体的制备原生质体的制备n n获得有活力、去壁较为完全的原生质体是原生质获得有活力、去壁较为完全的原生质体是原生质体融合育种技术的先决条件。体融合育种技术的先
4、决条件。n n在细菌和放线菌中，制备原生质体主要采用溶菌在细菌和放线菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；制备葡萄球菌的原生质体，则需用溶葡萄球酶；制备葡萄球菌的原生质体，则需用溶葡萄球菌素处理；制备酵母菌的原生质体时，菌素处理；制备酵母菌的原生质体时， 一般可用一般可用蜗牛酶；制备丝状真菌的原生质体时，可用蜗牛蜗牛酶；制备丝状真菌的原生质体时，可用蜗牛酶，在丝状真菌的原生质体制备中很少单独使用酶，在丝状真菌的原生质体制备中很少单独使用一种酶，而是采用两种或三种酶混合处理。一种酶，而是采用两种或三种酶混合处理。n n另外，影响原生质体制备的因素有许多，主要是另外，影响原生质体制备的因素有许多，主要
5、是 菌体的性质菌体的性质 ，酶的性质以及反应环境，酶的性质以及反应环境n n(1) (1) 菌体的前处理菌体的前处理 为了使酶的作用效果更好一些，为了使酶的作用效果更好一些，可对菌体作一些前处理，主要是在培养基中加入可对菌体作一些前处理，主要是在培养基中加入一些物质，加入这些物质的目的，就是使菌体的一些物质，加入这些物质的目的，就是使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加。例如：青霉素能干扰细胞壁对酶的敏感性增加。例如：青霉素能干扰甘氨酸交联桥与四肽侧链上的甘氨酸交联桥与四肽侧链上的DD丙氨酸之间的联丙氨酸之间的联结，使细菌不能合成完整的具有空间网络结构的结，使细菌不能合成完整的具有空间网络结构的细壁，
6、结果使细胞壁结构疏松，便于溶菌酶处理。细壁，结果使细胞壁结构疏松，便于溶菌酶处理。n n(2)(2)菌体的培养时间菌体的培养时间 微生物能否较好地形成原生质微生物能否较好地形成原生质体与微生物的生理状态有一定的关系。为了使菌体与微生物的生理状态有一定的关系。为了使菌体细胞易于原生质体比，一般选择对数生长期的体细胞易于原生质体比，一般选择对数生长期的菌体。这时的细胞正在生长，代谢旺盛，细胞壁菌体。这时的细胞正在生长，代谢旺盛，细胞壁对酶解作用最为敏感。由其得到的原生质体，形对酶解作用最为敏感。由其得到的原生质体，形成率高，再生率也很高。成率高，再生率也很高。 n n(1) (1) 酶浓度酶浓度
7、对于不同种属的微生物来说不仅对酶的种类要对于不同种属的微生物来说不仅对酶的种类要求不同，就是酶的浓度也有差异。一般地说，酶浓度增加，求不同，就是酶的浓度也有差异。一般地说，酶浓度增加，原生质体的形成率也增加，超过一定范围则原生质体形成原生质体的形成率也增加，超过一定范围则原生质体形成率的提高不明显。酶浓度过低，则不利于原生质体的形成；率的提高不明显。酶浓度过低，则不利于原生质体的形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率的降低。因此，有人建酶浓度过高，则导致原生质体再生率的降低。因此，有人建议以使原生质体形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度作议以使原生质体形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度作为最
8、佳酶浓度。为最佳酶浓度。n n (2) (2) 酶解温度酶解温度 据报道酶解温度对原生质体再生的影响很大。据报道酶解温度对原生质体再生的影响很大。因此，在选择最佳酶解温度时除了要考虑酶的最适温度外，因此，在选择最佳酶解温度时除了要考虑酶的最适温度外，还要用原生质体再生率加以校正还要用原生质体再生率加以校正 n n(3) (3) 酶解时间酶解时间 酶解时间过短，原生质体形成不完全，结果会酶解时间过短，原生质体形成不完全，结果会影响原生质体间的融合；酶解时间过长，原生质体脱壁太完影响原生质体间的融合；酶解时间过长，原生质体脱壁太完全，原生质体的质膜也易受到损伤，从而影响原生质体的再全，原生质体的质
9、膜也易受到损伤，从而影响原生质体的再生，最终也不利于原生质体融合。因此，为了使融合实验得生，最终也不利于原生质体融合。因此，为了使融合实验得以成功，必须要选择合适的酶解时间才行。以成功，必须要选择合适的酶解时间才行。n n(1)(1)渗透压稳定剂渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨胀作用，还有助于酶仅起到保护原生质体免于膨胀作用，还有助于酶和底物的结合。渗透压稳定剂多采用和底物的结合。渗透压稳定剂多采用KclKcl、NaClNaCl等等无机物和甘露醇、山梨醉、蔗糖、丁二酸钠等有无机物和甘露醇、山梨醉、蔗糖、丁二酸钠等有机物。菌株不同，最
10、佳稳定剂也有差异，在细菌机物。菌株不同，最佳稳定剂也有差异，在细菌中多用蔗糖，丁二酸钠、中多用蔗糖，丁二酸钠、NaClNaCl等；在酵母菌中多等；在酵母菌中多用山梨醉、甘露醇等；在霉菌中多用用山梨醉、甘露醇等；在霉菌中多用KclKcl和和NaClNaCl等。等。稳定剂的使用浓度一般均在稳定剂的使用浓度一般均在o o3 3一一o o8mol/L8mol/L之间。之间。n n 除此以外，破壁时的除此以外，破壁时的pHpH值、培养基成分、培养方值、培养基成分、培养方式、离子强度和种类等对原生质体的形成也有一式、离子强度和种类等对原生质体的形成也有一定的影响。定的影响。3 原生质体的再生原生质体的再生
11、n n酶解去壁后得到的原生质体应具有再生能力，即能酶解去壁后得到的原生质体应具有再生能力，即能重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、分裂，重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、分裂，这是原生质体融合育种的必要条件。仅有细胞质膜这是原生质体融合育种的必要条件。仅有细胞质膜的原生质体对渗透压很敏感、很容易破裂，致使原的原生质体对渗透压很敏感、很容易破裂，致使原生质外流而使细胞死亡。所以，再生培养基必须与生质外流而使细胞死亡。所以，再生培养基必须与原生质体内的渗透压相等。这就要在再生培养基中原生质体内的渗透压相等。这就要在再生培养基中加入具有一定渗透压的基质，即渗透压稳定剂加入具有一定渗透压的基质，
12、即渗透压稳定剂n n原生质体的再生是一个非常复杂的过程一些学者原生质体的再生是一个非常复杂的过程一些学者研究认为，若原生质体的细胞壁剥去得不太彻底，研究认为，若原生质体的细胞壁剥去得不太彻底，则有助于细胞壁的再生，残留的细胞壁尤如结晶时则有助于细胞壁的再生，残留的细胞壁尤如结晶时的的“ “晶种晶种” ”一样。大量实验也证明，破壁太彻底往一样。大量实验也证明，破壁太彻底往往会引起原牛质体再生率的大大降低往会引起原牛质体再生率的大大降低 n n在进行融合实验前，在进行融合实验前，般先要对原生质体再生率般先要对原生质体再生率进行测定，否则就很难确定不能融合或融合频率进行测定，否则就很难确定不能融合或
13、融合频率低是由于双亲原生质休本来就没有活性或再生率低是由于双亲原生质休本来就没有活性或再生率很低，还是由于融合条件不适合所致。因此，测很低，还是由于融合条件不适合所致。因此，测定原生质体形成率和再生率不仅可作为检查、改定原生质体形成率和再生率不仅可作为检查、改善原生质体形成和再生条件的指标，而且也是分善原生质体形成和再生条件的指标，而且也是分析融合实验结果，改善融合条件的一个重要指标。析融合实验结果，改善融合条件的一个重要指标。原生质体再生率的计算公式：原生质体再生率的计算公式：n n原生质体再生率（再生平板菌数原生质体再生率（再生平板菌数- -低渗剩余菌数）低渗剩余菌数）/ /（破壁前菌数（
14、破壁前菌数- -低渗剩余菌数）低渗剩余菌数）n n一般地说，原生质体的再生率常常只有百分之几一般地说，原生质体的再生率常常只有百分之几到百分之几十，各的甚至可达到百分之几十，各的甚至可达100100。如果原生质。如果原生质体不能恢复成原来菌的正常状态，那么微生物的体不能恢复成原来菌的正常状态，那么微生物的原生质体在遗传操纵工作方面的应用将是不可能原生质体在遗传操纵工作方面的应用将是不可能的。的。 4 原生质体的融合原生质体的融合n n仅仅将原生质体等量地混合在仅仅将原生质体等量地混合在 一起融合频率仍然很低，一起融合频率仍然很低，只有加入表面活性剂聚乙二醇只有加入表面活性剂聚乙二醇(PEG)(
15、PEG)，融合频率才会提高，融合频率才会提高，常用的常用的PEGPEG是相对分子量为是相对分子量为40004000和和60006000的两种。的两种。n n在原生质体融合过程中，除了要加入在原生质体融合过程中，除了要加入PEGPEG外，还要加入钙外，还要加入钙镁等阳离子，它们对融合也有促进作用。在有钙离子存在镁等阳离子，它们对融合也有促进作用。在有钙离子存在的条件下融合时的条件下融合时pHpH值为碱性能刺激产生最大的融合频率，值为碱性能刺激产生最大的融合频率，这是因为这是因为PHPH能够改变体系的电性状态，从而影响原生质体能够改变体系的电性状态，从而影响原生质体的融合。的融合。n n由于由于P
16、EGPEG既是融合剂又是渗透压稳定剂，浓度低于既是融合剂又是渗透压稳定剂，浓度低于 2020会会使原生质体破裂而失去稳定性，浓度过高又会引起原生质使原生质体破裂而失去稳定性，浓度过高又会引起原生质体收缩而降低融合频率，因此，融合时体收缩而降低融合频率，因此，融合时PEGPEG的最终浓度常的最终浓度常采用采用30%30%一一4040。由干。由干PEGPEG一加入，原生质体间的粘着即一加入，原生质体间的粘着即？强烈地发生，融合就能较长时间有效地进行，所以？强烈地发生，融合就能较长时间有效地进行，所以PEGPEG的处理时间不得太长。此外，的处理时间不得太长。此外，PEGPEG在高浓度下有毒，因此在高
17、浓度下有毒，因此也要求融合时间不宜过长。也要求融合时间不宜过长。n n有人指出，先用紫外线照时原生质体，再进行融合可以大有人指出，先用紫外线照时原生质体，再进行融合可以大大增加融合频率大增加融合频率 n n另外，利用物理因子也可以促进细胞融合，主要是电融合技术 。电融合是以空间定向，时间同步的可控方式来实现原生质体的融合，从而改变了化学融合(指用PEG融合)的随机过程。同时其融合频率高，操作简便、快速，对细胞损伤较小，并可以在显微镜下进行。5融合子的选择融合子的选择 n n原生质体融合后，重组子即融合子的选择方法是使原生质原生质体融合后，重组子即融合子的选择方法是使原生质体融合技术得以应用的关
18、键。按照体融合技术得以应用的关键。按照schaefferschaeffer的观点，有两的观点，有两个遗传标记互补就可以确定其为融合子。因此，就可以通个遗传标记互补就可以确定其为融合子。因此，就可以通过那些选择性遗传标记，在选择培养基上挑出融合子。但过那些选择性遗传标记，在选择培养基上挑出融合子。但是，由于原生质体融合后会产生两种情况，一种是真正的是，由于原生质体融合后会产生两种情况，一种是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是暂时的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是暂时的融合，形成异核体。两者均可以在选择培养基上生长，一融合，形成异核体。两者均可以在选择培养基上生长，一般
19、前者较稳定而后一种则是不稳定的，会分离成亲本类般前者较稳定而后一种则是不稳定的，会分离成亲本类型，有的甚至可以以异核状态移接几代。因此要获得真型，有的甚至可以以异核状态移接几代。因此要获得真正融合子，必须在融合原生质体再生后，进行几代自然分正融合子，必须在融合原生质体再生后，进行几代自然分离、选择，才能加以确定。离、选择，才能加以确定。n n常用的融合子筛选方法有两种：直接法常用的融合子筛选方法有两种：直接法, ,间接法和钝化选择间接法和钝化选择法法 (1)(1)直接法直接法直接法直接法 原生质体融合后直接分离到原生质体融合后直接分离到MMMM或或SMSM上，即可上，即可直接检出融合细胞。其优
20、点是只需一步就可得到重组体，直接检出融合细胞。其优点是只需一步就可得到重组体，而大多数重组体是稳定的，缺点是难以检出那些表型延而大多数重组体是稳定的，缺点是难以检出那些表型延迟而基因已重组的融合体。迟而基因已重组的融合体。 (2)(2)间接法间接法间接法间接法 把融合产物分离到把融合产物分离到CMCM上，使原生质体再生，上，使原生质体再生，融合和非融合的原生质体都能生长，再分离到融合和非融合的原生质体都能生长，再分离到SMSM上。其上。其优点是能促使细胞更好地再生，表型延迟重组体容易检优点是能促使细胞更好地再生，表型延迟重组体容易检出。缺点是需要两步才能检出重组体，需要相当大的人出。缺点是需要
21、两步才能检出重组体，需要相当大的人力和物力，而且得到的重组体不大稳定。力和物力，而且得到的重组体不大稳定。 直接法和间接法都要用营养缺陷性标记，所得重组体不直接法和间接法都要用营养缺陷性标记，所得重组体不一定能提高目的产物的产量。一定能提高目的产物的产量。 (3)(3)钝化选择法钝化选择法钝化选择法钝化选择法 钝化选择法是指灭活原生质体和具活性原钝化选择法是指灭活原生质体和具活性原生质体融合，把亲株中的一方（野生型）原生质体在生质体融合，把亲株中的一方（野生型）原生质体在50C50C热处理热处理2-32-3小时，使融合前原生质体代谢途径中的某小时，使融合前原生质体代谢途径中的某些酶钝化不能再生
22、，再与另一方（双缺陷性）原生质体些酶钝化不能再生，再与另一方（双缺陷性）原生质体融合，并分离到融合，并分离到mmmm上，灭活除用加热方法外，还可以用上，灭活除用加热方法外，还可以用紫外或药物处理。紫外或药物处理。6 实用性菌株的筛选实用性菌株的筛选n n 微生物原生质融合是一种新的基因重组技术，它具有定向育种的含义。但是，融合后所产生的融合子类型仍然是各种各样的。性能不同，产量不同的情况仍然存在，因此必要的人工筛选仍然很重要 ，主要是遗传稳定性等的实验。四四 原生质体融合育种的应用原生质体融合育种的应用 n n陈宁等以球形芽抱杆菌和苏云金芽泡杆菌H4为亲株(前者对淡色库蚊有高毒力，后者对粘虫、
23、玉米螟有高毒力)，在23 mg/ml溶菌酶浓度下，42C酶解45分钟，获得了原生质体，其原生质体形成率和再生率分别为91.2、37.6及93.3、31.2，然后将获得的原生质体以l:1比例混合，加入40的PEG于42C保温5min，结果获得了既杀双翅目又杀鳞翅日幼虫的融合子。 n n在链霉菌原生质体融合育种方面n n邢孔照等以巴龙霉素产生菌和新留素产生菌的高产变种营养缺陷型为亲株进行融合，产生原养型重组体的频率为10-4。其中有58%产生巴龙霉素，并从中获得了产量比原始菌株(300ug/ml)提高56倍的融合子。 n n杨昭中等以四环素产生菌金色链霉菌和正定霉素产生菌天蓝淡红链霉菌正定变种为亲株进行融合，以自身抗生素抗性为标记选择种间融合子，从而获得了一株正定霉素产量较亲株提高了2.6倍的融合子。 结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！22
