实时荧光定量pcr技术：定量分析功能及软件应用

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1、 CT 标准差小于0.5时候表示技术重复性好 实时荧光定量实时荧光定量 PCR 技术技术：定量分析功能及软件应用定量分析功能及软件应用 定量 PCR 除可以对样品的初始浓度进行准确定量外，还有其它多种丰富的应用。还包括基因表达调控情况的分析、等位基因的分析等，那么这些功能是如何在一台定量 PCR 仪上实现的呢？下面将进行一一介绍。 利用标准曲线对样品的初始浓度进行定量利用标准曲线对样品的初始浓度进行定量： 用已知浓度的标准品绘制标准曲线来对未知样品定量， 首先要有一组稳定的标准品。 标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒 DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的 PCR 产物，当然也可以是基因组

2、 DNA，甚至 cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必需保证稳定。一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。 以 Rotor-Gene3000的操作为例，以标准曲线对未知样品定量是默认的分析方法。软件可在反应尚在进行时就对结果进行分析， 结果随着反应的进行可实时更新， 当然也可以等反应完全结束后再进行分析。 点示“Analysis”，弹出分析框，默认分析功能即为“Quantitation”，点击“Show”，软件即自动给出包括标准曲线（包括 R 值，R 平方值，扩增效率、标准曲

3、线公式等） 、标准化的荧光曲线、各样品计算浓度（包括标准偏差、变异系数等）在内的结果。 若是使用 SYBR Green I 法，还可进行熔解曲线分析，以判断退火温度是否合适，产物中是否有引物二聚体的影响。对于 SYBR Green I 的客户，我们建议一定要在最后做一步熔解曲线的分析，这对于反应条件的优化和结果的正确判定都有着非常重要的作用。 同样，点击“Analysis”，在分析窗口中选择“Melt”，点击“Show”，自动给出分析结果。 完成了所需的分析之后，如还需给出分析结果报告，点击“Analysis”边上的“Report”选项，选择报告模板，软件自动给出报告。 利用定量技术进行基因型

4、分析研究利用定量技术进行基因型分析研究： 常用的分析方法有两种，一种是 Taqman 探针法，一种为 FRET 探针法（又称 Hyb 探针） ，运用以上两种方法进行基因型的分析需要一台有多通道的荧光定量 PCR 仪。Taqman 探针分析基因型是以扩增信号的有无来判定，而 FRET 探针则根据扩增后片段熔解温度的不同来判定。 以下为用 Taqman 探针判断基因型的实例： 这里，突变型的探针以 FAM 荧光素标记，野生型的探针以 VIC 荧光素标记，检测时分别同时检测了 FAM 通道和 VIC 通道的荧光情况。这里，3、4号样品只在 FAM 通道有信号，而在 VIC 通道里无信号，表明这两个样

5、品为突变型；1、2号样品在 FAM 通道无信号，在 VIC通道有信号，表明这两个样品为野生型；而5、6号样品在两个通道都有信号，但荧光强度恰为其它样品的一半，说明这两个样品为杂合型。 并且， 我们可以在软件里将不同的通道定义为不同的基因型， 软件会根据不同样品在各个通道的荧光情况，自动对各个样品的基因型做出判定。 以下为用 FRET 方法分析基因型的实例： 如上图，荧光探针与突变型完全匹配，而与野生型存在一个碱基的错配，因而打开这两组双链所需的能量就不同， 具体体现在熔解温度的差异上， 因而突变型的样本有较高的熔解温度，而野生型的样品熔解温度相对较低。在图中，5号样本熔解温度较低，为野生型；2

6、号样本熔解温度较高，为突变型；而1、3、4号样品在高温和低温处都出现了熔解峰，则它们为杂合型。 并且用户还可以将不同的峰定义为不同的基因型， 软件可根据用户的定义自动给出未知样品的基因型。如上图表格中所示。 利用相对定量的方法分析目的基因的上下调情况利用相对定量的方法分析目的基因的上下调情况： 基因表达调控研究中，常用的相对定量方法主要有两种，Delta-deltaCt 法和双标准曲线法。 由于 RNA 纯化后得率不同、RNA 反转录为 cDNA 的效率不同等客观因素，用于定量分析 的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以 校正因样品初始浓度不同而造成的

7、差异。常用的看家基因有 beta-actin，GAPDH，18SrRNA 等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。我们分 别来看看以上两种相对定量分析方法的特点和应用。 Delta-deltaCt： 由 Delta-delta Ct 的公式可以看出，该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同时默认两个基因扩增效率一致。 Comparative Delta-delta Ct 法的特点、注意事项及实际应用： 1. Comparative Delta-delta Ct 法的一大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需

8、对待测样品分别进行 PCR 扩增即可。 2. 每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。 用 Comparative Delta-delta Ct 法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。 Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的 R 值、 扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即 M 值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用 Comparative Delta-delta Ct 法进行相对定量分析。反之，如果 M 差值大于0.1，就无法

9、用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。 下面是某科研用户用 Delta-delta Ct 进行相对定量分析的实例： 首先，该客户分别做了目的基因和看家基因的确标准曲线，根据软件自动给出的 M 值判断该方法的可行性： 如下图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。从上图可知，两组标准曲线的 M 值分别为-3.525和-3.467，两者的差值0.1，因此，这组看家基因和目的基因可

10、以用 Comparative Delta-delta Ct 法进行相对定量。 确定这两个基因可以用 Delta-delta Ct 法分析后，用户扩增了其待测样品的目的基因和看家基因。经软件自动分析后，给出分析结果，如下： 我们看到，在该客户的实验中，以样品 A 为对照组，软件自动组出了样品 B 和 C 的目的基因相对于样品 A 的表达情况。 这种方法对于样品量大，但研究的基因数目相对较少的客户特别有用，因为一旦条件优化好之后就无需再做标准曲线，节约了试剂和样品量，实验操作也相对简单。 双标准曲线法双标准曲线法： 公式： 双标准曲线法考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率。 双

11、标准曲线法的特点、注意事项及实际应用： 1. 双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像 Delta-delta CT 法那样对实验进行严格的优化。 2. 其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。 并且，如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化的 PCR 产物，而待测样品为 cDNA，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在一定误差。 每种相对定量方法都会有一定的局限性，对于双标准曲线法，比较适合于样本量不大，但研究的基因较多的客户，这样对不同基因条件优化相对 Delta-delta

12、Ct 法更为简单。 下面是某科研用户用双标准曲线法进行相对定量分析的实例。 要用该方法进行分析，客户在一轮反应中，对目的基因和看家基因分别做了一组标准曲线，同时也分别扩增的待测样品的目的基因和看家基因。 如下图，选择软件中相应的分析方法。 软件自动给出分析结果： 同样，结果自动给出了待测样品相对于对照组目的基因的表达情况。 比较定量法比较定量法： 另一种相对定量分析方法叫比较定量法(ComparativeQuantitation)，该方法在芯片结果验证中的应用相对较多。 比较定量法的特点、注意事项及实际应用： 1必需确定起始样品的总核酸浓度一致。在芯片验证时使用较多，但同样也必需有起始浓度一致

13、的核酸样品。 2作为常规的基因表达调控研究，建议研究者使用前两种定量方法。 3该方法通过拐点时的循环数来进行相对定量比较，重复性更好。 4该方法操作非常简便，无需做标准曲线及设置内参。使用时，样品均定义为 unknown，分析时选用 ComparativeQuantitation，确定对照组，完成分析。 应用实例： 用 Comparative Quantitation 法进行定量分析时，在保证起始总核酸量一致的前提下，只要对目的基因进行扩增即可，例：待测样品 A、B、C，扩增目的基因。在软件中选择相应方法，即得以下结果： 上图左下方即相对表达量的结果， 其中 Rep.Conc 为样品 B、 C

14、 相对于对照组 A 的目的基因浓度。右侧，可通过修改 Calibrator Replicate 改变对照组，以获得不同的比较结果。 、荧光定量分析方法荧光定量分析方法 我们在设计实验的时候通常对下列事情更感兴趣：1）测定未知样品的绝对量：如给定的血样中的病毒颗粒数，食品中某一种转基因成分的含量；2）未知样品与已知样品相比，基因的表达量改变了多少倍：如相当量的肿瘤组织和正常组织相比，p53mRNA 改变了多少倍。分析这两种假设的方法就分别叫绝对定量和相对定量。 绝对定量绝对定量是通过样品的 Ct 值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总 RNA）中核酸的

15、量（拷贝数、微克） 。 相对定量相对定量的分析结果是在相当量的试验组（样品 A）和对照组（样品 B）中一个靶基因的相对比率（倍数差异） 。 接下来我们就来看看我们在实验过程中如何来使用绝对定量和相对定量的分析方法。 51绝对定量分析方法绝对定量分析方法 511绝对定量分析方法的使用条件绝对定量分析方法的使用条件 在这里我将举例来说明我们在实验过程中，何种实验需要用绝对定量来进行分析。医生对一个乙肝病人的每毫升血液中 HBV DNA 的精确拷贝数感兴趣。首先医生要从病人血液中提取 DNA，然后通过荧光定量 PCR实验来确定 HBV 病毒 DNA 的 copy 数。通过病人样品的 Ct 值和设置梯

16、度稀释的已知 HBV 对照样品的标准曲线进行比较，医生就能确定病人血液中 HBV 病毒 DNA 的 copy 数。从这个例子，我们也可以看出，在实验过程中，如果最终的结果是对未知样品的定量描述，并不依赖别的样品的性质的时候，就应该使用绝对定量进行分析。 512绝绝对定量数据处理对定量数据处理（举例举例） ：） ：确定某病人的血液提取的确定某病人的血液提取的 HBV 病毒的精确量病毒的精确量 如：PCR 反应结束后，我们得到如下数据： copies/ml Ct1 Ct2 Ct3 Mean Ct STD 5103 27.61 27.58 27.84 27.67667 0.13 5104 24.25 24.42 24.55 24.40667 0.08 5105 21.11 21.04